當歸多糖ASP1體內外特異性肝靶向研究.pdf

1、當歸多糖是中藥當歸的主要生物活性成分,在抗貧血、抗腫瘤、肝損傷、免疫作用等方面具有顯著活性。本實驗以岷縣當歸飲片為原料,采用水提、酸堿除蛋白的方法提取當歸飲片中的當歸總多糖,再經醇沉、超濾分級分離和葡聚糖凝膠G50分離純化得到精制當歸多糖組分,命名為ASP1;當歸多糖ASP1經異硫氰酸熒光素(FITC)標記,成為可發(fā)射熒光的物質,在此基礎上對當歸多糖ASP1體內外特異性肝靶向作用進行研究。
　　第一部分，當歸多糖ASP1的提取、分

2、離和純化
　　以岷縣當歸飲片為原料,采用水提、酸堿除蛋白的方法提取當歸飲片中的當歸總多糖,經醇沉、超濾分級分離除掉小分子色素和寡糖等雜質,再經葡聚糖凝膠G50進一步分離純化得到精制當歸多糖組分,命名為ASP1。通過測定ASP1糖含量、相對分子質量,以及進行碘-碘化鉀實驗和紫外掃描鑒定純度。經苯酚-硫酸法測得ASP1糖含量為90.8％,高效凝膠色譜法測得其相對分子質量為8.780×104Da,碘-碘化鉀實驗及紫外掃描圖譜顯示ASP1

3、不含淀粉、蛋白質和核酸。結果表明,本實驗制備得到分子量均一、純度高的當歸多糖ASP1組分。
　　第二部分，當歸多糖ASP1的熒光標記、產物分析及生物樣品中的穩(wěn)定性考察
　　當歸多糖ASP1進行FITC熒光標記,標記產率為83%。采用紫外可見光譜法、熒光光譜法和高效凝膠滲透色譜法考察ASP1熒光標記效率。紫外可見光譜分析結果顯示,ASP1標記產物在494nm附近出現特征吸收峰,而未標記的ASP1不具有此特征吸收峰,紫外可見分光

4、光度法測定其FITC的取代度為1.18%(w/w)。熒光光譜分析結果顯示,ASP1標記產物有較強的熒光強度,其λex=494nm,λem=520nm。經高效凝膠滲透色譜分析,ASP1標記產物的相對分子質量為8.870×104Da,標記前后ASP1分子量未發(fā)生明顯變化,表明熒光標記對ASP1結構影響較小。本實驗采用高效凝膠滲透色譜熒光檢測法測定ASP1標記產物加入生物樣品前后的分子量和熒光強度,考察ASP1標記產物在0.01MPBS溶液、

5、體外血漿樣品和體內血漿樣品中的穩(wěn)定性。結果顯示,在0.01MPBS溶液和體外血漿樣品中,ASP1標記產物的分子量和熒光強度于避光37℃,60rpm孵育條件下20h內均未發(fā)生明顯改變;大鼠尾靜脈給藥2h后取血樣測定標記產物分子量,其分子量未發(fā)生改變,表明ASP1在生物樣品中的穩(wěn)定性良好。本實驗制備的ASP1標記產物產率高、取代度適宜、熒光強度較高、穩(wěn)定性良好,適用于后續(xù)當歸多糖ASP1體內外特異性肝靶向研究。
　　第三部分，當歸多糖

6、ASP1的體內肝靶向性研究
　　1.生物樣品中ASP1含量測定方法的建立
　　利用ASP1標記產物可發(fā)射熒光的性質,本實驗建立了高效液相色譜熒光檢測法測定生物樣品中ASP1含量的方法。該方法經方法學確證,ASP1在各生物樣品中的定量下限為0.20μg/mL,在0.25~20.00μg/mL范圍內濃度與峰面積呈良好的線性關系,r2﹥0.999。測定0.5μg/mL、2.5μg/mL和25.0μg/mL三種不同濃度下樣品的回收率

7、和精密度,測得回收率在91.98%~114.20%之間,精密度相對標準偏差符合要求。樣品在4℃避光條件下放置3天、-20℃避光條件下放置7天穩(wěn)定性良好。該方法樣品用量少、靈敏度高、特異性強、精密度和重現性較好,適用于藥代動力學和組織分布實驗大量樣本的檢測。該方法的建立為研究當歸多糖ASP1在大鼠體內的藥代動力學和組織分布奠定了方法學基礎。
　　2.ASP1在大鼠體內的藥代動力學和組織分布研究
　　測定12mg/kg劑量的AS

8、P1經尾靜脈給藥后在SD大鼠體內的藥物濃度-時間數據,采用DAS2.1.1版軟件擬合房室模型并計算出藥動學參數,得出ASP1在大鼠體內的最佳模型為兩室模型,ASP1的t1/2=15.931min,CL=0.001L/min/kg,MRT(0-∞)=23.536min。參考ASP1的藥時曲線和藥代動力學參數,確定ASP1尾靜脈給藥后在大鼠體內的組織分布取樣時間點為30min、60min和120min。組織分布結果顯示,給藥后除肝臟中ASP

9、1濃度大幅升高外,其它組織中ASP1濃度均較低。給藥120min后,血液中ASP1濃度降至Cmax的1/60以下,此時ASP1在血液和各組織中濃度由高到低依次為肝?血液>腸>心>脾>肺>胃>腎>腦,肝臟中ASP1的濃度高出其它組織中濃度的30倍以上,充分說明ASP1具有很強的特異性肝靶向作用。本課題組研究結果表明當歸多糖ASP1的粒徑范圍為0.6~1.2μm,在肝和脾的被動靶向粒徑范圍內。給藥后,ASP1濃集于肝臟而在脾臟中的濃度很低,

10、且多數研究表明肝臟和脾臟對于同一藥物的被動靶向作用較為相近,由此可初步推斷ASP1對肝的被動靶向作用較弱,主動靶向作用占主導地位。
　　3.ASP1體內肝靶向的肝組織切片觀察
　　大鼠尾靜脈注射120mg/kg劑量的ASP1作為實驗組,注射生理鹽水作為陰性對照組,120min后處死大鼠并制備肝臟組織切片,激光共聚焦顯微觀察結果顯示,實驗組肝臟切片的熒光強度明顯高于陰性對照組,且實驗組肝臟切片中大部分ASP1進入到肝細胞胞漿,

11、細胞間質分布較少,表明ASP1經肝細胞胞吞進入細胞內,由此進一步證實了ASP1具有很好的主動肝靶向作用。
　　第四部分，當歸多糖ASP1的體外肝靶向性研究
　　采用原位膠原酶灌流法提取大鼠原代肝細胞,構建當歸多糖ASP1體外特異性肝靶向研究模型。該方法提取得到的肝細胞活力高于90%,其中肝實質細胞所占比例較大。向大鼠原代肝細胞(1×106)中分別加入50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL濃度梯度的ASP1標記產物

12、作為實驗組,加入空白培養(yǎng)基作為陰性對照組,共培養(yǎng)2h后進行流式細胞儀檢測。結果顯示,實驗組原代細胞的熒光強度在加入ASP1標記產物后發(fā)生顯著改變(與陰性對照組相比,*p﹤0.05),且細胞熒光強度隨ASP1濃度遞增而加強。與陰性對照組相比,實驗組原代肝細胞中熒光強度增加的細胞數目占總體細胞數目的比例(即靶向率)隨著ASP1濃度遞增而加大,50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL劑量組的靶向率分別為73.93%、94.83%和9