靶向特異性基因的小干擾RNA抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的研究.pdf

1、[目的]研究靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF-1R)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)的小干擾RNA(siRNA)對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的抑制作用；構(gòu)建靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)雙基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)真核表達(dá)載體并鑒定，用于膠質(zhì)瘤基因治療。 [方法]第一、二部分：體外化學(xué)合成靶向IGF-1R和IGF-1基因的siRNA，脂質(zhì)體法將siRNA以不同濃度梯度轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，同時(shí)使用綠色熒光素

2、標(biāo)記的小干擾RNAFITC-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察siRNA轉(zhuǎn)染效率；RT-PCR和Westernblot測(cè)定RNA干擾后IGF-1R和IGF-1的表達(dá)水平：采用Transwell體外侵襲試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞體外的侵襲力分析；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和周期；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)測(cè)定IGF-1R和IGF-1基因表達(dá)下調(diào)后膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)致瘤能力的改變。 第三部分：分別設(shè)計(jì)并體外合成靶向基因VEGF、NGF的特異性編碼shRN

3、A序列的寡核苷酸，克隆到經(jīng)BglⅡ—HindⅢ酶切線性化的pSUPER質(zhì)粒H1啟動(dòng)子下游，構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒，進(jìn)而脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，半定量RT-PCR檢測(cè)VEGFmRNA、NGFmRNA表達(dá)。 [結(jié)果]第一部分：熒光顯微鏡下熒光素標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染組可見到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)清晰的綠色熒光，脂質(zhì)體OligofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染效率接近100％：靶向IGF-1R基因的siRNA可以有效抑制IGF-1

4、R基因的表達(dá)，各特異性siRNA不同濃度轉(zhuǎn)染組IGF-1RmRNA表達(dá)水平可下調(diào)約10％-80％，蛋白表達(dá)減少50％；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率轉(zhuǎn)染組為22．47％±3．15％，與陰性對(duì)照組2．3％±0．9％和空白對(duì)照組1．14％±0．79％比較有明顯提高，而陰性、空白對(duì)照組相比無明顯差異；腫瘤細(xì)胞的侵襲力明顯下降，在裸鼠體內(nèi)成瘤的能力大大降低。 第二部分：靶向IGF-1基因的siRNA可以有效抑制IGF-1基因的表達(dá)。熒光顯微鏡

5、下熒光素標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染組可見到細(xì)胞內(nèi)清晰的綠色熒光，脂質(zhì)體OligofectamineTM2000的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)95％以上：各特異性siRNA不同濃度轉(zhuǎn)染組IGF-1mRNA表達(dá)水平可下調(diào)約40％-70％，蛋白表達(dá)減少60％，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染IGF1-siRNA細(xì)胞凋亡率為15．07％，與對(duì)照組(1．98％)比較有明顯提高，腫瘤細(xì)胞的侵襲力明顯下降(P＜0．01)，降低了在裸鼠體內(nèi)成瘤的能力(P＜0．01)。 第三部分：