14-3-3蛋白對神經(jīng)元存活及其缺血損傷的保護(hù)作用和機(jī)制.pdf

1、14-3-3蛋白存在于所有真核生物中，在腦組織中含量非常豐富，約占腦組織中可溶性蛋白總含量的1%。已知哺乳動物細(xì)胞中14-3-3蛋白共有7種亞型：γ、β、ζ、ε、σ、τ、η，在細(xì)胞增殖分裂、生長分化、凋亡、代謝等生命活動過程中發(fā)揮重要作用。14-3-3蛋白在腦內(nèi)的本質(zhì)功能還不清楚。前期研究表明在缺血缺氧的星形膠質(zhì)細(xì)胞中14-3-3γ蛋白的表達(dá)增加。
　　 本文主要研究14-3-3蛋白對神經(jīng)元存活及缺血損傷的保護(hù)作用。首先為了探討

2、14-3-3蛋白對神經(jīng)細(xì)胞存活的作用，在小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a)及原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞中過表達(dá)14-3-3蛋白抑制肽Difopein以抑制14-3-3與其配體蛋白的結(jié)合，Hoechst染核細(xì)胞計(jì)數(shù)，MTT及熒光微孔板細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白動態(tài)檢測結(jié)果都顯示抑制內(nèi)源性14-3-3的功能后神經(jīng)元死亡明顯增加，證明在正常情況下神經(jīng)元的存活依賴于14-3-3蛋白功能的正常發(fā)揮。其次為了研究14-3-3蛋白對缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷是否也有保護(hù)作用，我們

3、在N2a細(xì)胞中分別過表達(dá)Difopein和14-3-3不同亞型后予缺糖缺氧（OGD）處理，Hoechst染核及MTT檢測結(jié)果證實(shí)抑制14-3-3蛋白加劇了OGD導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，雖然過表達(dá)14-3-3不同亞型對細(xì)胞有保護(hù)作用，但14-3-3γ對OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用最明顯。我們進(jìn)一步探討了14-3-3γ在神經(jīng)元中抗凋亡的保護(hù)機(jī)制。在N2a細(xì)胞中抑制14-3-3功能后caspase 3明顯激活，siRNA抑制內(nèi)源性的14-3-3γ并

4、予缺糖缺氧處理后發(fā)現(xiàn)Bax表達(dá)增加，caspase 3激活，表明14-3-3γ抗凋亡作用主要是通過抑制Bax-caspase 3途徑來實(shí)現(xiàn)的。在大鼠腦缺血再灌注（MCAO）模型中免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果也證實(shí)14-3-3γ陽性的細(xì)胞中P53、Bax表達(dá)量低，表明14-3-3γ是通過下調(diào)P53、Bax水平從而抑制線粒體凋亡途徑。同時(shí)在缺血半陰影區(qū)神經(jīng)元內(nèi)還發(fā)現(xiàn)14-3-3γ有明顯的核轉(zhuǎn)位，提示14-3-3γ可能通過與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合直接調(diào)控凋亡基因