MBL基因多態(tài)性及其血漿濃度與新生兒感染的關(guān)系.pdf

1、感染是導(dǎo)致新生兒，尤其是早產(chǎn)兒和低出生體重兒發(fā)病和死亡的一個(gè)重要的、常見(jiàn)的原因，其嚴(yán)重影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育和智力發(fā)育，給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。已有的文獻(xiàn)報(bào)道，新生兒感染易發(fā)生于先天性免疫功能低下的患兒，與遺傳、先天性免疫系統(tǒng)發(fā)育異常等因素有關(guān)。近年來(lái)的研究表明，甘露糖結(jié)合凝集素（mannose-binding lectin，MBL）缺陷作為最常見(jiàn)的免疫缺陷狀態(tài)，是我國(guó)新生兒感染的重要原因。MBL是先天性免疫系統(tǒng)的重要分子，它可以與

2、病原微生物表面的糖鏈結(jié)合，通過(guò)膠原樣區(qū)激活MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶，進(jìn)而激活補(bǔ)體系統(tǒng)，對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟的新生兒尤其是早產(chǎn)兒，甘露糖結(jié)合凝集素在防御抵抗多種病原微生物感染的天然免疫中起著重要的作用，是嬰幼兒非特異性免疫系統(tǒng)中的一線抗感染分子。血漿MBL濃度主要受其基因多態(tài)性影響：基因編碼區(qū)的突變可以破壞MBL膠原樣區(qū)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致MBL多肽鏈不能寡聚化，而易被降解成無(wú)功能蛋白。啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleoti

3、de polymorphisms，SNPs）則從轉(zhuǎn)錄水平影響MBL的濃度。目前研究主要集中在MBL基因啟動(dòng)子區(qū)的-550，-221和5'UTR+4位點(diǎn)和外顯子1區(qū)+223、+230和+239位點(diǎn)的基因多態(tài)性上。
　　本研究通過(guò)PCR（Polyrnerase Chain Reaction，PCR）和直接測(cè)序的方法，分析福建地區(qū)新生兒MBL基因已知六個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性，并試圖發(fā)現(xiàn)新的基因多態(tài)性位點(diǎn)，進(jìn)一步探討MBL基因多態(tài)性-血漿MBL濃

4、度-新生兒感染三者之間的關(guān)系。
　　目的：1.研究福建地區(qū)漢族新生兒MBL啟動(dòng)子區(qū)和外顯子1已知6個(gè)位點(diǎn)的基因型及由此所構(gòu)成的單體型。
　　2.分析MBL基因型及其單體型在早產(chǎn)兒和足月兒間的差異，探討MBL基因多態(tài)性與早產(chǎn)的相關(guān)性。
　　3.探討MBL基因型及其單體型與血漿MBL濃度的相關(guān)性。
　　4.分析MBL基因多態(tài)性、血漿MBL濃度與新生兒感染包括肺炎、敗血癥之間的相關(guān)性。
　　5.發(fā)現(xiàn)本地區(qū)漢族新生

5、兒MBL基因新的多態(tài)性位點(diǎn)。
　　方法：1.收集福建省婦幼保健院新生兒救護(hù)中心2013年1-6月期間的182例患兒，其中對(duì)照組87例，感染組95例，分為新生兒肺炎組和新生兒敗血癥組，其診斷主要依據(jù)患兒的臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和影像學(xué)資料。
　　2.針對(duì)擬研究的6個(gè)位點(diǎn)的序列，自行設(shè)計(jì)引物。提取全血 DNA后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測(cè)序分析。
　　3.用ELISA法檢測(cè)不同基因型的血漿MBL濃度。
　　4.

6、收集患兒的病例資料以及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，并用SPSS軟件分析MBL基因型及單體型與新生兒感染的關(guān)系。
　　結(jié)果：1.182例漢族新生兒中啟動(dòng)子區(qū)-550位點(diǎn)G/G、G/C和C/C基因型頻率分別為0.236、0.489和0.275，G和C型等位基因頻率分別為0.481和0.519。-221位點(diǎn)C/C、C/G和G/G基因型頻率為0.055、0.308和0.637，C和G等位基因頻率分別為0.209和0.791。5’UTR+4位點(diǎn)C/C

7、、C/T和T/T基因型頻率為0.764、0.214和0.022，C和T等位基因頻率為0.87和0.13。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，啟動(dòng)子區(qū)3個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率符合Hardy-weinberg平衡。+230位點(diǎn)G/G、G/A和A/A基因型頻率為0.731、0.247和0.022，G和A等位基因頻率分別為0.854和0.146。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，該位點(diǎn)的等位基因頻率也符合Hardy-weinberg平衡。
　　2.經(jīng)SHEsis軟件分析，-550、-2

8、21位點(diǎn)和+230位點(diǎn)間均存在較高度的連鎖不平衡。本研究中包括啟動(dòng)子和外顯子1區(qū)的單體型共有6種：HYPA、LYPB、LYPA、LXPB、LXPA和LYQA，其中HYPA最常見(jiàn)，頻率為0.463，其他單體型頻率分別為0.137、0.062、0.009、0.2和0.111。
　　3.早產(chǎn)組和足月兒組啟動(dòng)子區(qū)域的三個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)中，-550位點(diǎn)變異型等位基因頻率在足月兒組和早產(chǎn)兒組無(wú)顯著性差異（χ2值為2.04，P>0.05）。-221位

9、點(diǎn)在早產(chǎn)兒組C和G等位基因頻率分別為0.268和0.732，而足月兒組C和G等位基因頻率分別為0.160和0.840，兩者間具有顯著性差異(χ2值為5.9,P<0.05)。+4位點(diǎn)的 C和 T型等位基因頻率在早產(chǎn)兒組和足月兒組間無(wú)顯著性差異(χ2值0.467,P>0.05)。外顯子1區(qū)三個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)中只有+230位點(diǎn)多態(tài)性改變，其中G和A等位基因頻率在早產(chǎn)兒和足月兒組中無(wú)顯著性差異(χ2值為0.739，P>0.05)。共檢出5種單體型LX

10、PA、LYPB、LYPA、LYQA和HYPA，其中早產(chǎn)兒組LXPA明顯高于足月兒組，OR值1.794(95％CI1.06～3.017，P<0.05)，而LYPB在足月兒組明顯高于早產(chǎn)兒組，其OR值0.533(95%CI0.28～0.99，P<0.05)，其它三種單體型在兩組之間差別無(wú)顯著性差異。
　　4.除了6個(gè)已知位點(diǎn)的多態(tài)性改變外，還發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)-327到-332位點(diǎn)間AGAGAA共6個(gè)堿基丟失，且有4例出現(xiàn)純合性丟失。同時(shí)在

11、該位點(diǎn)的上下游同時(shí)出現(xiàn)了-435G/A、-427A/C、-349A/G、-336A/G和-70C/T的多態(tài)性改變。經(jīng)連鎖不平衡檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn) c.4665-4670delAGAGAA、-435G/A、-427A/C、-349A/G、-336A/G和-70C/T各多態(tài)位點(diǎn)間具有強(qiáng)連鎖性。
　　5．MBL基因啟動(dòng)子區(qū)-550和+4位點(diǎn)變異型等位基因頻率在感染組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差別，感染組-221位點(diǎn)變異型等位基因頻率高于正常對(duì)照組(0.

12、722 vs0.644，χ2=7.14，P<0.05)，+230位點(diǎn)感染組的A型等位基因頻率為0.141，而對(duì)照組中則為0.061，感染組顯著高于對(duì)照組(χ2=6.4，P<0.05)。比較不同組別MBL單體型頻率發(fā)現(xiàn)，感染組LYPB和LYQA的頻率高于對(duì)照組(0.129 vs0.021、0.152 vs0.001,χ2=14.74、27.9,P<0.005)，而LYPA的頻率低于對(duì)照組(0.072 vs0.238,χ2=20.2,P<0

13、.05)，其它單體基因型頻率在疾病組與對(duì)照組間相比無(wú)顯著性差異。
　　6.對(duì)照組的MBL濃度中位數(shù)1560 ng/ml，感染組MBL濃度中位數(shù)452 ng/ml，對(duì)照組血漿MBL濃度明顯高于感染組，差別有顯著性意義(z=-4.566，P=0.000)。同時(shí)將感染組分成新生兒肺炎組和敗血癥組，將對(duì)照組和各疾病組MBL濃度進(jìn)行比較，其中位數(shù)值分別為1560ng/ml、445 ng/ml和770 ng/ml，差別有顯著性意義(Z值分別為

14、-4.33和-2.85，P<0.05)。而各疾病組間濃度差異無(wú)顯著性。
　　7.基因型與MBL濃度的關(guān)系：外顯子是影響血漿MBL表達(dá)的最關(guān)鍵因素，產(chǎn)物表達(dá)A/A>A/B>B/B，其血漿MBL濃度中位數(shù)分別為2409ng/ml、1069 ng/ml和33.3ng/ml，有顯著性差異（P<0.001）。在外顯子相同的情況下，HYP/HYP型患者的MBL濃度（3400 ng/ml）最高，而LYP/LYQ型濃度（310 ng/ml）最低。

15、
　　結(jié)論：1.我省漢族MBL基因-550、-221、+4和+230位點(diǎn)呈現(xiàn)不同程度的多態(tài)性改變；+223和+239位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性改變。
　　2.我省漢族新生兒?jiǎn)误w型有HYPA、LYPB、LYPA、LXPB、LXPA和LYQA，其中以HYPA最多見(jiàn)；新發(fā)現(xiàn)LYQ A單體基因型。
　　3.單體型在早產(chǎn)兒和足月兒組中分布頻率不同，LXPA是早產(chǎn)的危險(xiǎn)因子，而LYP B是保護(hù)因子。
　　4.檢出C.4665-467

16、0delAGAGAA多態(tài)性改變，這些病例中同時(shí)出現(xiàn)-435G/A、-427A/C、-349A/G、-336A/G和-70C/T等位點(diǎn)的多態(tài)性改變，各位點(diǎn)間具有強(qiáng)連鎖性。
　　5. MBL基因多態(tài)性改變與新生兒感染相關(guān)，單體型LYPB和LYQA感染組明顯高于正常組，而LYPA則相反。
　　6.低血漿 MBL濃度是引起新生兒感染的危險(xiǎn)因素之一；對(duì)照組和感染組間MBL濃度顯著性差異，而感染組間MBL水平無(wú)顯著性差異。
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