大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在心肌梗死及心力衰竭中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增的可行性;(2)移植的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞能否在心肌梗死部位存活;(3)移植于瘢痕部位的干細(xì)胞在心肌微環(huán)境下能否表達(dá)心肌特異性蛋白標(biāo)志,橫向分化為心肌樣表型;(4)是否改善梗死大鼠的心功能狀態(tài).材料與方法:1.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的準(zhǔn)備:取大鼠腹腔麻醉,用含10﹪胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,制成細(xì)胞懸液.1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘去除上清和脂肪,PBS液洗滌3次.用含10﹪胎牛血清、青霉

2、素(100U/ml)、鏈霉素(100ug/ul)的DMEM-LG培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,接種到塑料培養(yǎng)皿中(Falcon 3002),置于37℃,5﹪CO2,95﹪濕度培養(yǎng)箱中.24小時(shí)首次換液去除懸浮生長細(xì)胞,以后每隔3天換液一次,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況.細(xì)胞約80﹪融合時(shí),棄去皿內(nèi)培養(yǎng)液,用PBS液洗滌3次,加入0.25﹪胰蛋白酶消化,接種到3個(gè)培養(yǎng)皿中(首次傳代)當(dāng)?shù)诙蝹鞔募?xì)胞接近80﹪融合時(shí),5-aza加入培養(yǎng)液中24

3、h,終濃度10μmol/L.為鑒定移植于心肌瘢痕中的異體細(xì)胞,移植前進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記,將BrdU加入培養(yǎng)液共孵育48h,終濃度0.1mg/ml培養(yǎng)液.2.大鼠心肌梗死模型的制作:取成年大鼠,腹腔麻醉,氣管插管,正壓通氣,80次/分鐘.大鼠左側(cè)開胸1.5cm,打開心包,暴露心臟.8-0無損傷縫線結(jié)扎左冠狀動脈回旋支,待局部心肌顏色蒼白后逐層關(guān)胸.3.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的移植:心肌梗死后2周,大鼠麻醉,心臟暴露如前.0.25﹪胰蛋白酶消化貼壁生長的

4、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,用含10﹪胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度2×10<'7>個(gè)/ml培養(yǎng)液,共0.1ml,將細(xì)胞懸液注入實(shí)驗(yàn)組大鼠心梗部位(n=12),并用8-0無損傷縫線"C"形結(jié)扎進(jìn)針口,關(guān)胸及術(shù)后護(hù)理.培養(yǎng)液對照組(n=9)、PBS對照組(n=9)操作同上.4.超聲學(xué)評價(jià)心功能:心肌梗死后2周大鼠麻醉,12MHz高頻探頭于乳頭肌水平記錄左心室二維超聲心動圖.超聲學(xué)評價(jià)其心功能狀態(tài),計(jì)算FS﹪=(LVEDD-LVESD)/L

5、VEDD×100.細(xì)胞移植后2周再次行超聲學(xué)檢查.5.免疫組織化學(xué):心臟固定、石蠟包埋.心肌梗死部位連續(xù)切片,厚度5μm,行HE染色和免疫組織化學(xué)染色.6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),樣本均數(shù)用x±S表示,顯著性水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05.結(jié)論:1.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞適宜于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增.2.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植2周后于心肌部位存活.3.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植2周后已在梗死部位表達(dá)心肌特異性蛋白標(biāo)志,橫向分化為心肌樣表型.4.