大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與移植治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的:急性心肌梗死是一種常見的、多發(fā)的心臟疾病,因其死亡率高及心力衰竭等并發(fā)癥而嚴(yán)重威脅著人類的健康。傳統(tǒng)的治療方法僅能減緩或改善心肌梗死的病程,不能使已壞死的心肌細(xì)胞再生。近年來,許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床前期試驗(yàn)證實(shí),細(xì)胞移植治療法可增加有功能的心肌細(xì)胞的數(shù)量,改善心臟功能。干細(xì)胞中的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow stromal stem cells,BMSCs),由于其取材方便、可以體外培養(yǎng)增殖、免疫排斥反應(yīng)小和無倫理

2、道德問題等優(yōu)點(diǎn),正在成為組織工程細(xì)胞移植術(shù)中理想的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)旨在探討體外分離培養(yǎng)BMSCs的方法、BMSCs的定向誘導(dǎo)分化及移植治療MI的細(xì)胞學(xué)機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容和方法:(1)BMSCs的體外分離培養(yǎng)與鑒定:以沖洗法獲得4周齡Wistar大鼠骨髓;并以1×107個(gè)/ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,24小時(shí)后首次換液,當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80～90％時(shí),再以2×105個(gè)/ml的密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢

3、測(cè)第3代細(xì)胞表面抗原CD29、CD34、CD90的表達(dá)情況對(duì)BMSCs進(jìn)行鑒定。(2)BMSCs體外定向誘導(dǎo)及誘導(dǎo)細(xì)胞的鑒定:以5-aza對(duì)培養(yǎng)48小時(shí)的第3代BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo),設(shè)1μmol/L/5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L誘導(dǎo)濃度,24h換液去除誘導(dǎo)劑。取10μmol/L誘導(dǎo)后培養(yǎng)14、21天的細(xì)胞,采用細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)橫紋肌肌動(dòng)蛋白Actin和縫隙連接蛋白43的表達(dá)情況。(3)大鼠心肌梗死模

4、型(cute myocardial infarction,MI)的建立:采用開胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支法制作MI大鼠模型,并以心電圖、組織切片、TTC染色和心臟外觀的變化評(píng)價(jià)MI模型。(4)移植細(xì)胞的標(biāo)記及MI大鼠心肌內(nèi)細(xì)胞移植:以50μg/ml DAPI標(biāo)記第3代BMSCs,并調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/50μL,1小時(shí)內(nèi)將細(xì)胞注射入大鼠心肌梗死部位。(5)移植細(xì)胞存活與分化的檢測(cè)及初步治療效果的觀察:在熒光顯微鏡下觀察免疫熒光染色的組

5、織切片,判斷是否存在同時(shí)發(fā)藍(lán)色熒光和紅色熒光的細(xì)胞。通過心電圖檢測(cè),組織切片觀察及毛細(xì)血管密度變化評(píng)價(jià)細(xì)胞移植治療效果。
　　 結(jié)果:(1)原代培養(yǎng)24小時(shí)后即可見少量的圓形細(xì)胞貼壁,后逐漸生長呈長梭形纖維樣細(xì)胞,有集落形成,12天左右第一次傳代。傳代培養(yǎng)時(shí)剛貼壁的細(xì)胞呈圓形,很快伸展為短梭形、長梭形及不規(guī)則多邊形。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長曲線近似“S”形,迅速增值時(shí)間3-5天,第7天進(jìn)入平臺(tái)期。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果是CD29、CD3

6、4和CD90的陽性表達(dá)率分別為84.8％、3.2％和95.3％(2)比較誘導(dǎo)結(jié)果得出最適誘導(dǎo)濃度為10μmol/L,此濃度誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)類似于心肌樣細(xì)胞。細(xì)胞免疫化學(xué)顯示,誘導(dǎo)細(xì)胞陽性表達(dá)Actin和CX43。說明誘導(dǎo)后的BMSCs定向分化為心肌樣細(xì)胞(3)AMI大鼠模型評(píng)價(jià):實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組大鼠的心電圖相比,出現(xiàn)Q波異常和/或ST段抬高(0.2-0.4mV)和/或T波倒置。另外,MI大鼠心肌組織切片觀察到:心肌細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)紊亂,核固

7、縮且染色加深,有的核甚至溶解消失。TTC染色顯示梗死部位顯白色,正常組織呈深紅色。證明了MI模型的制作成功,成功率為65.51％。(4)細(xì)胞移植對(duì)MI大鼠的治療效果初步評(píng)價(jià):細(xì)胞移植3周后心電圖檢測(cè)顯示基本恢復(fù)正常。HE染色的組織切片中存在核漿比例較大、生長排列方向與肌纖維一致的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組中毛細(xì)血管密度大于對(duì)照組,改善了心臟的供血功能。細(xì)胞移植大鼠的組織切片免疫熒光檢測(cè),發(fā)現(xiàn)存在既發(fā)藍(lán)色熒光又發(fā)紅色熒光的細(xì)胞,說明移植的BMSCs在梗