阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者膽固醇外流功能的改變及機制研究.pdf

1、背景
　　 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnoea hypopneasyndrome，OSAHS）作為嚴重影響人類健康的常見疾病，目前被認為是心血管疾病的獨立危險因素。研究也發(fā)現(xiàn)，心血管疾病可能發(fā)生在OSAHS的早期，甚至在沒有經典的心血管疾病危險因素的OSAHS患者中發(fā)生動脈粥樣硬化，早發(fā)的動脈粥樣硬化是OSAHS患者心血管疾病發(fā)病率和病死率升高的原因之一。動脈粥樣硬化形成的早期標志是

2、巨噬細胞吞噬脂質形成泡沫細胞，并在動脈壁沉積。高密度脂蛋白（HDL）及其介導的膽固醇逆向轉運（RCT）是機體抗動脈粥樣硬化的重要機制之一，巨噬細胞膽固醇外流是膽固醇逆轉運過程中的重要的初始步一驟，而三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCAl）、三磷酸腺苷結合盒轉運體G1（ATP binding cassette transporter G1，ABCGl）和清道夫受體B1

3、（scavenger receptor class B1，SR-BI）都是重要的介導巨噬細胞內膽固醇流出的細胞表面蛋白。目前已知在炎癥、脂質紊亂以及糖代謝異常等疾病過程中，這一過程障礙導致的保護功能喪失是發(fā)生動脈粥樣硬化的重要原因。睡眠呼吸暫停在動脈粥樣硬化形成中所起的重要的作用已得到人們重視，也有研究已經證實在體外OSAHS患者的HDL-C功能存在異常，但其具體機理仍不清楚。
　　 目的
　　 1.通過對OSAHS患者

4、外周血單核巨噬細胞膽固醇外流功能及其相關受體的研究，探討OSAHS患者早發(fā)動脈粥樣硬化的相關機制。
　　 2.建立OSAHS鼠模型，并在OSAHS鼠動脈內膜及腹腔巨噬細胞中，觀察間斷低血氧對于膽固醇外流及其相關受體以及對動脈粥樣硬化形成的影響。
　　 方法
　　 1.收集北京協(xié)和醫(yī)院經多導睡眠圖（polysomnography，PSG）確診的OSAHS患者和年齡及性別匹配的健康對照，根據(jù)AHI（呼吸紊亂指數(shù)，ap

5、nea hyponea index，AHI）將其分為三組：對照組，輕中度OSAHS組，重度OSAHS組，所有受試者均抽取外周靜脈血30ml，進行血脂、血糖、hsCRP等生化指標的檢測。
　　 2.采用密度梯度離心和粘附法分離、純化人外周血單核細胞，體外培養(yǎng)并巨噬化后，在mRNA水平，用RT PCR方法研究人單核巨噬細胞上ABCAl、ABCGl和SR-BI的表達水平；在蛋白水平，用Western Blot方法檢測人單核巨噬細胞上的

6、ABCAl的蛋白表達。
　　 3.使人外周血單核巨噬細胞負載3H放射性同位素標記的膽固醇，分別用空白對照、自身血清、HDL及APOAl誘導細胞內膽固醇外流，測定膽固醇外流率。
　　 4.成功建立OSAHS鼠動物模型，并于間斷低氧處理18周時處死實驗動物，分離鼠主動脈，觀察其動脈內皮動脈粥樣硬化病變情況。
　　 5.收集鼠腹腔巨噬細胞分別研究對照組和間斷低氧組兩組鼠腹腔巨噬細胞ABCAl、ABCGl和SR-BI的m

7、RNA表達水平及蛋白表達情況，并應用3H放射性同位素法測定鼠巨噬細胞膽固醇外流率。
　　 6.統(tǒng)計方法：采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以X±SD表示，組間比較以one-way ANOVA進行分析，線性相關應用Pearson’s相關分析，回歸分析采用多重線性回歸分析方法。
　　 結果：
　　 1.在對照組、輕中度OSAHS組和重度OSAHS組三組之間，AHI（2.14±1.28，18.77±8.50

8、 vs62.9±20.7）、Hs-CRP（0.366±0.19，1.02±0.68 vs4.95±3.45）、平均血氧飽和度（96.6±1.34，95±1.73 vs93.5±1.22）和最低血氧飽和度（92.4±1.82，87±6.24 vs76.1±4.92）均存在顯著性差異（P均<0.05），其余所有指標包括年齡、性別、BMI、腰圍、血壓、血糖及各種血脂指標的水平等在三組間均無統(tǒng)計學差異。
　　 2.RT PCR檢測結果發(fā)

9、現(xiàn)與對照組（0.534±0.012）相比，輕中度（0.394±0.037）和重度OSAHS組患者（0.344±0.039）單核巨噬細胞表面ABCAl mRNA的表達顯著降低（P均<0.05），其降低程度與OSAHS嚴重程度一致。輕中度OSAHS患者（0.37334±0.02）與重度OSAHS患者（0.3544±0.03）和對照組（0.48084±0.02）相比，ABCGl的表達是也明顯降低的（P<0.05），但是在輕中度OSAHS組和重

10、度OSAHS組之間沒有觀察到顯著性差別（P=0.21）。對照組、輕中度OSAHS組和重度OSAHS組SR-BI mRNA的表達（0.35814±0.03，0.364±0.02，0.394±0.05）在各組間無顯著差別（p均>0.05）。
　　 3.Western Blot檢測結果發(fā)現(xiàn)，隨著睡眠呼吸障礙的程度加重，ABCAl的蛋白表達水平明顯下降。
　　 4.在正常對照組患者、輕中度OSAHS組和重度OSAHS組患者中，A

11、poAl誘導人外周血單核細胞來源的巨噬細胞的膽固醇外流率分別為：13.3％±3.9％，6.6％±2.1％，3.3％±1.6％（患者與對照組相比P均<0.01）；HDL誘導的膽固醇外流率分別為：10.5％±12.5％，9.4％±10.2％，6.9％±7.2％，有下降趨勢（P分別為0.59、0.34和0.32）；自身血清誘導的膽固醇外流水平分別為：17.5％±5.4％，9.4％±3.2％，5.5％±1.9％，三組之間均存在統(tǒng)計學差異（P<0

12、.01）。
　　 5.多重線性回歸分析及Pearson’s相關分析均顯示：ABCAl的表達水平與AHI之間存在負相關（r=-0.831，p<0.001），血清介導的膽固醇外流率和ApoAl介導的膽固醇外流率與AHI之間也都存在負相關（分別為r=-0.917，r=-0.880，P<0.001），提示隨著AHI的升高，ABCAl的表達水平、ApoAl介導的通過ABCAl作用的膽固醇外流率及血清介導的膽固醇外流率都是降低的。
　

13、　 6.間斷低氧處理至18周時，金黃地鼠主動脈內皮均未見明顯粥樣斑塊或脂質條紋形成。
　　 7.18周時間斷低氧的金黃地鼠巨噬細胞表面ABCAl、ABCGl和SRBI三種受體的mRNA的表達與對照組相比，均有不同程度的增加。分別為0.46±0.03 vs0.36±0.02，0.60454±0.12 vs0.41±0.03，0.63±0.15 VS0.3486±0.04（P均<0.05）。
　　 8.Western Bl

14、ot結果提示，在間斷低氧組金黃地鼠的腹腔巨噬細胞上，ABCAl、ABCGl的蛋白表達都是增高的。
　　 9.在對照組和OSAHS組金黃地鼠中，ApoAl、HDL和自身血清誘導腹腔巨噬細胞的膽固醇外流率分別為：38.5％±8.5％vs45.8％±9.0％（P=0.833），52.9％±2.8％VS70.5％±4.5％（P=0.1），40.7％±12.1％vs65.5％±4.4％（P=0.197），間斷低氧組的膽固醇外流率比對照組均

15、有增高趨勢，但都沒有統(tǒng)計學差異。
　　 結論
　　 1.在OSAHS患者中，單核巨噬細胞ABCAl的基因及蛋白表達顯著下降，并且隨著睡眠呼吸暫停的程度加重，其下降趨勢越來越明顯。
　　 2.OSAHS患者巨噬細胞膽固醇外流能力明顯受損，以ABCAl通路介導的膽固醇外流下降為主。
　　 3.ABCAl、ABCGl的mRNA表達及血清和APOA1介導的膽固醇外流能力均與AHI呈顯著負相關，AHI是影響OSAH