調(diào)節(jié)性T細胞對日本血吸蟲GST疫苗保護性效果的影響及機制研究.pdf

1、寄生蟲能逃避宿主的免疫攻擊而繼續(xù)生存的現(xiàn)象稱為免疫逃避，其機理為分子模擬與偽裝、封閉抗體的產(chǎn)生等多種方式逃避宿主的體液和細胞免疫攻擊，因而寄生蟲能在宿主體內(nèi)長期存在并引起慢性感染。新近證實，調(diào)節(jié)性T細胞與寄生蟲逃避宿主免疫攻擊有關(guān)，即“病原體可能會利用調(diào)節(jié)性T細胞當做逃生的窗口”，如利什曼原蟲感染部位聚集了大量的調(diào)節(jié)性T細胞而有利于原蟲的存活，若用抗體阻斷調(diào)節(jié)性T細胞則有利于機體清除原蟲。調(diào)節(jié)性T細胞最早于1995年由Sakaguchi

2、等描述，主要包括自然性和誘導性調(diào)節(jié)性T細胞兩種類型。誘導性調(diào)節(jié)性T細胞由外來抗原誘導產(chǎn)生，自然性調(diào)節(jié)性T細胞即CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞，來源于胸腺并維持于外周，組成性表達CD25、Foxp3、CTLA-4和GITR等分子。CD25分子即IL-2受體的α鏈，對于維持調(diào)節(jié)性T細胞增殖及功能具有重要作用，但CD25分子同時也表達于活化的效應(yīng)細胞表面，因而不具有特異性。Foxp3為核轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)節(jié)性T細胞的特征性標志。CTLA-4（細胞

3、毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4）是一種共抑制性受體，CTLA-4與機體的免疫耐受功能相關(guān)。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞能抑制CD4+和CD8+效應(yīng)T細胞的激活，其抑制功能是由調(diào)節(jié)性T細胞與效應(yīng)細胞之間直接接觸或者由調(diào)節(jié)性T細胞分泌抑制性細胞因子IL-10和TGF-β來實現(xiàn)的，單獨及聯(lián)合使用相應(yīng)的阻斷性抗體有利于機體清除寄生蟲感染。日本血吸蟲疫苗的研究經(jīng)歷了死疫苗、減弱活疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗的漫長過程，仍未取得較好的效果。WHO推薦的

4、六種候選疫苗包括谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶均不能穩(wěn)定地獲得40％以上的保護力。既然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞能抑制效應(yīng)T細胞反應(yīng)，因此推測日本血吸蟲在宿主體內(nèi)免疫逃避及日本血吸蟲疫苗的免疫保護性效果不佳均可能與調(diào)節(jié)性T細胞有關(guān)。本文一方面探討了日本血吸蟲感染與調(diào)節(jié)性T細胞之間的關(guān)系，采用相應(yīng)抗體阻斷調(diào)節(jié)性T細胞，觀察其對機體清除日本血吸蟲感染能力的影響及其作用機制。另一方面探討了日本血吸蟲疫苗與調(diào)節(jié)性T細胞之間的關(guān)系，采用相應(yīng)抗體阻斷調(diào)節(jié)性T

5、細胞觀察其對日本血吸蟲疫苗免疫保護性效果的影響及其作用機制。本課題分為以下二個部分：一、
　　 CD4+CD25+Tregs在日本血吸蟲免疫逃避中的作用及機制研究目的：通過觀察日本血吸蟲感染對CD4+CD25+Tregs的影響及使用anti-CD25 mAb對CD4+CD25+Tregs的影響，了解CD4+CD25+Tregs在日本血吸蟲免疫逃避中的作用及其機制。方法：動物實驗分為三個部分第一部分 6～8周齡雌性BALB/c小鼠

6、隨機分成二組，即正常對照組和感染組，感染組每只小鼠感染日本血吸蟲尾蚴40條，分別在感染后2周、3周、4周和5周剖殺小鼠，流式細胞術(shù)檢測各組小鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+Tregs的比例。第二部分 6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成二組，即正常對照組和anti-CD25 mAb組，抗體組腹腔注射300 μg anti-CD25 mAb，對照組注射等體積的PBS，使用抗體后2周剖殺小鼠，無菌取脾，制備單個脾淋巴細胞懸液，流式細胞術(shù)檢

7、測各組小鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+Tregs百分比。第三部分 6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成二組，即感染對照組和anti-CD25 mAb組。每只小鼠感染日本血吸蟲尾蚴40條，感染后2周，抗體使用組每只小鼠腹腔注射300 μg anti-CD25 mAb，感染對照組注射等體積的PBS。感染后6周剖殺各組小鼠。計數(shù)蟲荷和每克肝臟內(nèi)蟲卵數(shù)，計算減蟲率和每克肝臟組織中減卵率。無菌取各組小鼠脾臟，制備單個脾淋巴細胞懸液，收集脾細胞

8、培養(yǎng)上清，夾心ELISA法檢測脾細胞上清中細胞因子含量。結(jié)果：
　　 1）日本血吸蟲感染后2周、3周、4周和5周，小鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+Tregs百分比由感染前的1.99±0.10％分別上升至2.36±0.37％、2.8±0.05％、2.35±0.09％和2.68±0.05％。提示日本血吸蟲感染可誘導機體CD4+CD25+Tregs升高。
　　 2）正常對照組小鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+Tregs百分比

9、平均值為1.99±0.10％，使用anti-CD25 mAb后2周百分比平均值為0.20±0.05％，抗體組明顯低于對照組（P<0.01）。提示anti-CD25 mAb可部分阻斷CD4+CD25+Tregs。
　　 3）使用anti-CD25 mAb組小鼠蟲荷較未使用抗體組減少18.99％，每克肝臟蟲卵數(shù)減少15.86％。提示CD4+CD25+Tregs下降有利于宿主對血吸蟲的清除。
　　 4）使用anti-CD25

10、mAb組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IFN-γ、IL-5明顯高于感染對照組。
　　 結(jié)論：Anti-CD25 mAb能部分阻斷CD4+CD25+Tregs，使用后有利于機體清除日本血吸蟲。
　　 二、CD4+CD25+Tregs對日本血吸蟲GST疫苗保護性效果的影響及其作用機制目的：通過觀察日本吸蟲GST疫苗對CD4+CD25+Tregs的影響及anti-CD25 mAb對CD4+CD25+Tregs表達的影響，探討CD

11、4+CD25+Tregs對疫苗GST免疫保護效果的影響及其作用機制。方法：雌性BALB/c小鼠隨機分成五組，正常組、感染對照組、anti-CD25 mAb組、GST組以及anti-CD25 mAb與GST聯(lián)合組。GST組和聯(lián)合組小鼠背部皮下多點注射日本血吸蟲GST疫苗50 μg/鼠，每次間隔2周，共免疫三次，末次免疫后2周，每只小鼠感染日本血吸蟲尾蚴40條，感染后2周，anti-CD25 mAb組和聯(lián)合組小鼠腹腔注射anti-CD25

12、mAb 300 μg/鼠，對照組注射等體積的PBS。分別在感染后2周、3周、4周和5周剖殺四組小鼠。無菌取各組小鼠脾臟，制備單個脾淋巴細胞懸液，流式細胞術(shù)檢測脾淋巴細胞中CD4+CD25+Tregs百分比；收集脾細胞培養(yǎng)上清，夾心ELISA法檢測脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子含量。感染后5周剖殺的小鼠同時計數(shù)蟲荷和每克肝臟蟲卵數(shù)，計算減蟲率和每克肝組織中減卵率。小鼠肝組織石蠟切片HE染色，觀察各組小鼠蟲卵肉芽腫的變化。結(jié)果：
　　 1

13、）日本血吸蟲感染后2周，感染對照組與GST組脾淋巴細胞中CD4+CD25+Tregs百分比平均值分別為2.36±0.37％和3.36±0.06％；感染后3周，其百分比平均值分別為2.8±0.05％和2.97±0.08％；感染后4周，其百分比平均值分別為2.35±0.09％和2.47±0.09％；感染后5周，其百分比平均值分別為2.68±0.05％和3.03±0.13％。提示GST疫苗能誘導機體CD4+CD25+Tregs升高。
　

14、　 2）使用anti-CD25 mAb后1周（即感染后3周），感染對照組與anti-CD25 mAb組小鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+Tregs百分比平均值分別為2.8±0.05％和0.13±0.04％；使用anti-CD25 mAb后2周（即感染后4周），百分比平均值分別為2.35±0.09％和0.9±0.23％；使用anti-CD25 mAb后3周（即感染后5周），百分比平均值分別為2.68±0.05％和1.93±0.03％。提

15、示使用anti-CD25 mAb后1周能部分封閉CD4+CD25+Tregs，使用anti-CD25 mAb后2周、3周其百分比逐漸上升，但仍明顯低于感染對照組。
　　 3）GST組小鼠對日本血吸蟲減蟲率及減卵率分別為24.98％和32％，而GST與anti-CD25 mAb聯(lián)合組減蟲率及減卵率分別為43.43％和49％。提示anti-CD25 mAb可作為佐劑增強疫苗GST的保護性效果。
　　 4）日本血吸蟲感染早期以

16、Th1型免疫反應(yīng)為主，感染后4周雌蟲排卵后以Th2型免疫反應(yīng)為主，而使用anti-CD25 mAb后Th1型細胞因子IFN-γ仍維持在較高水平，有利于機體清除日本血吸蟲。提示anti-CD25 mAb增強GST疫苗免疫保護性效果的機制為增強機體內(nèi)Th1型免疫反應(yīng)。
　　 5）病理組織學檢查顯示各感染組單個蟲卵肉芽腫直徑及浸潤細胞無明顯差異。提示anti-CD25 mAb未明顯增強小鼠肝臟蟲卵肉芽腫的病理變化。結(jié)論：日本血吸蟲GS

17、T疫苗能誘導CD4+CD25+Tregs比例上升，因而會影響疫苗的保護性效果；anti-CD25 mAb能部分阻斷CD4+CD25+Tregs，同時增強Th1型免疫反應(yīng)，因而能提高GST疫苗的免疫保護性效果，因此anti-CD25 mAb能作為佐劑增強GST疫苗的保護性效果。本研究結(jié)論如下：
　　 1）寄生蟲的免疫逃避與CD4+CD25+Tregs有關(guān)，CD4+CD25+Tregs升高有利于血吸蟲逃避宿主的免疫攻擊。
　　

18、 2）首次證明日本血吸蟲GST疫苗的保護性效果與宿主的CD4+CD25+Tregs有關(guān)，GST疫苗在感染背景下能誘導小鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+Tregs升高，從而影響GST疫苗的保護性效果。
　　 3）首次證明anti-CD25 mAb可增強日本血吸蟲GST疫苗的保護性效果，其作用機制是通過阻斷CD4+CD25+Tregs和增強Th1型免疫反應(yīng)來實現(xiàn)的。
　　 4）首次提出 anti-CD25 mAb可作為佐劑