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文檔簡介
1、目的:構(gòu)建日本血吸蟲組織蛋白酶B(Sjcb2)原核表達(dá)載體pWR450-1/Sjcb2并表達(dá);構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/Sjcb2,轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,并將pcDNA3.1(+)/Sjcb2直接肌注BALB/c小鼠,觀察其所誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,初步研究該核酸疫苗對BALB/c小鼠誘導(dǎo)的免疫保護(hù)性作用,為研制新型抗日本血吸蟲感染核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:用PRIMER5.0引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)引物,P
2、CR法擴(kuò)增Sjcb2基因片段,將PCR產(chǎn)物純化后與pUCm-T載體連接,經(jīng)藍(lán)白斑篩選、雙酶切分析和PCR鑒定后,亞克隆入pWR450-1原核表達(dá)載體及pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中,經(jīng)抗生素(氨芐青霉素)篩選、雙酶切鑒定、PCR鑒定及測序鑒定后,將構(gòu)建的pWR450-1/Sjcb2重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE及Westernblotting鑒定表達(dá)情況。構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/Sjcb2
3、重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察其在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況;將核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Sjcb2注射到BALB/c小鼠后腿股四頭肌肌肉組織中,每2周免疫一次,共免疫3次。末次免疫后2周,用日本血吸蟲尾蚴攻擊感染BALB/c小鼠。PCR及免疫組化法分析Sjcb2基因在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性及表達(dá)情況;MTT法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性增殖反應(yīng);ELISA雙抗體夾心法測定攻擊感染前后小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-
4、4的水平;瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)測定小鼠血清中Sjcb2抗體水平;攻擊感染42天后剖殺小鼠,計(jì)算小鼠所荷成蟲對數(shù)及肝臟所荷蟲卵數(shù)。 結(jié)果:成功構(gòu)建pWR450-1/Sjcb2重組原核表達(dá)載體,并在E.coliDH5α中表達(dá)出一分子量約為86KDa的重組融合蛋白;成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)/Sjcb2真核表達(dá)重組體,電穿孔轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)法表明Sjcb2能在HeLa細(xì)胞胞漿中表達(dá)。將核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Sj
5、cb2免疫BALB/c小鼠后,提取小鼠后腿股四頭肌的總DNA并用PCR擴(kuò)增,疫苗組結(jié)果顯示在第一次免疫后第1、3、7、10、14天、第二次免疫后14天及第三次免疫后14、28天均可檢測到Sjcb2基因的存在,pcDNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗在小鼠肌肉組織或細(xì)胞中能長期穩(wěn)定存在。用免疫組化法檢測該基因的表達(dá),結(jié)果顯示疫苗組小鼠的肌細(xì)胞中有散在的陽性顆粒。免疫后小鼠抗體檢測顯示DNA疫苗組小鼠在第一次免疫后7天開始出現(xiàn)抗體,第14
6、天達(dá)高峰。脾細(xì)胞培養(yǎng)MTT法檢測細(xì)胞增殖,結(jié)果顯示DNA疫苗組脾細(xì)胞在SWAP或PHA刺激時(shí)顯著高于pcDNA3.1組和生理鹽水組(P<0.05)。于攻擊感染前后剖殺小鼠,進(jìn)行脾細(xì)胞培養(yǎng)上清的細(xì)胞因子檢測,結(jié)果顯示攻擊感染前DNA疫苗組IFN-γ在SWAP或PHA刺激時(shí)顯著高于pcDNA3.1組和生理鹽水組(P<0.05),攻擊感染后仍維持較高水平;而攻擊感染前DNA疫苗組分泌IL-4的水平與pcDNA3.1組和生理鹽水組無顯著性差異(
7、P>0.05),攻擊感染后,DNA疫苗組與pcDNA3.1組和生理鹽水組仍無顯著性差異,但與攻擊感染前比較則有增高(P<0.05),并以pcDNA3.1組和生理鹽水組增高比較明顯。小鼠肝臟荷蟲卵數(shù)結(jié)果顯示pcDNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗免疫組與pcDNA3.1組及生理鹽水組小鼠的肝臟蟲卵數(shù)之間均有顯著性差異(P<0.05),而pcDNA3.1組與生理鹽水組小鼠蟲卵數(shù)之間無顯著性差異(P>0.05);小鼠所荷成蟲對數(shù)結(jié)果提示pc
8、DNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗免疫組與pcDNA3.1組及生理鹽水組小鼠之間所荷成蟲數(shù)均有顯著性差異(P<0.05),而pcDNA3.1組與生理鹽水組之間無顯著性差異(P>0.05)。計(jì)算減卵率和減蟲率,減卵率為60.61%,減蟲率為36.32%。 結(jié)論:成功擴(kuò)增日本血吸蟲組織蛋白酶B(Sjcb2)基因,構(gòu)建了pWR450-1/Sjcb2原核表達(dá)載體,并于大腸桿菌中表達(dá);構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/Sjcb2真核表達(dá)重
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