NOR-,1-基因?qū)epG2細胞基因譜表達影響的研究.pdf

1、目的： 1、 建立穩(wěn)定的NOR1基因轉(zhuǎn)染肝癌細胞系pcDNA3.1(+)/NOR1-HepG2。 2、 應(yīng)用大通量的基因芯片技術(shù)和熒光定量Real-time PCR技術(shù)，分析轉(zhuǎn)染NOR1基因?qū)Ω伟┘毎礖epG2基因表達譜的影響。 3、 探討NOR1基因與差異表達基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機制。 方法： 1、 將NOR1基因重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NOR1(實驗組)和空白載體pcDNA3

2、.1(+)(對照組)通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染至HepG2細胞中，用G418篩選陽性克隆，建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞系pcDNA3.1(+)/NOR1-HepG2(HepG2-NOR1)和pcDNA3.1(+)-HepG2(HepG2-pc)擴大培養(yǎng)后提取細胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)對NOR1基因的表達進行鑒定。 2、 選擇生長良好的實驗組與對照組培養(yǎng)細胞，分別提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用人17K基因表達譜芯片對實驗組和對

3、照組細胞基因組進行表達分析，統(tǒng)計表達差異在2倍以上的基因。 3、 用Real-time PCR對芯片檢測的部分差異表達基因進行進一步驗證。 結(jié)果： 1、 RT-PCR結(jié)果顯示實驗組NOR1基因表達明顯高于對照組，表明pcDNA3.1(+)/NOR1能在HepG2細胞中表達。 2、 人17K基因表達譜芯片檢測顯示實驗組與對照組比較有162個基因(或EST)表達差異在2倍以上，其中59條表達上調(diào)、103條表達

4、下調(diào)，涉及細胞凋亡或腫瘤相關(guān)、細胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號傳導(dǎo)、翻譯調(diào)控等基因。 3、 Real-time PCR對p15、MAGE-A6檢測，實驗組的表達量分別為對照組的2.692/2.989和2.535/2.118(Real-timePCR結(jié)果/芯片結(jié)果)，與芯片檢測結(jié)果相符。cDNA基因芯片和Real-timePCR都是研究差異表達基因的有力方法，基因芯片篩選基因表達譜具有高通量大規(guī)模的特點，而熒光定量Real-time PC

5、R則適合單個基因表達變化的研究，兩者互為補充和印證。 結(jié)論： 1、 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NOR1在肝癌細胞HepG2中穩(wěn)定表達，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/NOR1后肝癌細胞HepG2的基因表達譜發(fā)生改變。NOR1基因可能是與肝癌相關(guān)的抑瘤/易感基因侯選者之一。基因芯片技術(shù)為大規(guī)模篩選疾病相關(guān)基因及各基因間相互作用提供了可能。 2、 經(jīng)Real-time PCR驗證，P15和MAGE-A6基因在實驗組