RNA干擾技術沉默CDC25a基因?qū)θ烁伟〩epG2細胞增殖和裸鼠移植瘤的影響.pdf

1、目的:觀察基因干擾（RNAi）細胞分裂周期素25a(Cell division cycle25a，CDC25a)對人肝癌細胞系HepG2 CDC25a基因的mRNA、蛋白表達水平的影響，對人肝癌細胞系HepG2細胞增殖的影響，對人肝癌系HepG2細胞裸鼠移植瘤模型瘤體生長的影響。探討CDC25a可能的作用機制。
　　方法:1.采用實時熒光定量PCR法檢測三種細胞:HepG2、SMMC-7721及Sk-hep-1中CDC25a基因中

2、mRNA的表達水平，篩選實驗所需要的目的細胞。
　　2.通過RNA干擾技術構建5個靶向CDC25a基因siRNA慢病毒載體(CDC25a-RNAi載體)，將載體轉染至肝癌HepG2細胞。
　　3.本實驗隨機分為三組:實驗組為CDC25a基因沉默組，用慢病顆粒(LV-CDC25a-RNAi)感染HepG2細胞;陰性對照組使用對照慢病毒顆粒(LV-RNAi-NC)感染HepG2細胞;空白對照組不做任何處理，為正常培養(yǎng)的HepG2

3、細胞。干擾效果以及有效靶點的篩選通過RT-PCR、實時熒光定量PCR和Western blot技術檢測CDC25a基因mRNA及蛋白的表達進行綜合評價選擇，在5個靶點中篩選轉染效率最高的一個靶點。
　　4.采用RT-PCR和實時熒光定量PCR來檢測HepG2細胞中的CDC25a作用基因CyclinE及CDK2兩個基因的mRNA表達水平。
　　5.采用噻唑藍(MTT)法、Giemsa染色法檢測細胞的增殖能力，流式細胞技術來檢測

4、細胞周期。
　　6.將30只雌性裸鼠隨機分為3組，每組10只，分別在雌性裸鼠左側腋窩下0.5-1cm處的皮下接種3組細胞（實驗組，陰性對照組，空白對照組），形成瘤體（即成功構建裸鼠移植瘤模型）以后連續(xù)4周觀察裸鼠移植瘤體的生長速度并記錄下相應時間段的瘤體大小。4周以后測定腫瘤體積和重量并檢測移植瘤中CDC25a基因的mRNA和蛋白的表達水平。
　　結果:1.人肝癌系HepG2細胞中CDC25a基因的mRNA表達水平高于SMM

5、C-7721、SK-hep-13，且細胞表達的基因豐度適合做敲減驗證，選取HepG2細胞選為實驗細胞。
　　2.將帶有5種靶點CDC25a-RNAi干擾序列的慢病毒載體感染人肝癌系HepG2細胞，細胞熒光顯示感染率＞95％。5種靶點CDC25a-RNAi干擾序列在實驗組的細胞中形成穩(wěn)定轉染，與陰性對照及空白對照組相比，實驗組細胞中CDC25a的mRNA和蛋白的表達水平顯著下降(P＜0.05)，陰性對照與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意

6、義(P＞0.05);其中以LV-CDC25a-RNAi(9928-1R)(KD1)靶點的沉默效應最高，選擇該靶點進行后續(xù)實驗。
　　3.與陰性對照及空白對照組相比，實驗組細胞Cyclin E及Cdk2兩種基因的mRNA表達水平明顯降低(P＜0.05)，陰性對照與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　4.MTT結果顯示:實驗組細胞在使用CDC25a-RNAi慢病毒形成穩(wěn)定轉染，與陰性對照及空白對照組相比，細胞在

7、48、72、96及120h時間點時490nm處的吸光光度值均降低(P＜0.05)，在24h時實驗組的吸光度數(shù)據(jù)值雖然低空白對照組，但其差異無統(tǒng)計學意義(P=0.065)。Giemsa染色法結果顯示:實驗組的克隆數(shù)為24，明顯低于陰性對照組(克隆數(shù)98)和空白對照組（克隆數(shù)99），差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，陰性對照與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。流式細胞的結果顯示則實驗組細胞被阻滯在G1期，無法進入S期。

8、>　　5.實驗組裸鼠、陰性對照組裸鼠及空白對照組裸鼠在接種各組生長狀態(tài)良好的HepG2細胞后均能夠形成腫瘤，與陰性對照及空白對照組裸鼠相比，實驗組裸鼠移植瘤速度減慢、瘤體的體積減小、重量減輕(P＜0.05)，陰性對照與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。此外，與陰性對照及空白對照組相比，實驗組中CDC25a基因mRNA及蛋白表達明顯下降(P＜0.05)。
　　結論:1.沉默HepG2細胞的CDC25a基因后能有效的抑制