TET1介導(dǎo)的DNA羥甲基化對(duì)胃癌相關(guān)基因PTEN和EpCAM表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、目的：表觀遺傳學(xué)對(duì)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控已成為腫瘤研究領(lǐng)域中一個(gè)重要的研究方向。而DNA甲基化與去甲基化狀態(tài)的改變是表觀調(diào)控最經(jīng)典的研究方向。DNA的羥甲基化是近幾年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的，可以使 DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生改變的調(diào)控方式。DNA羥甲基化主要是由TET家族的TET1，TET2和TET3介導(dǎo)的。實(shí)體組織中的羥甲基化主要由 TET1來(lái)完成。目前已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，TET蛋白在諸多腫瘤中表達(dá)量明顯下降，以及隨之出現(xiàn)的基因組5-hmC含量的下調(diào)。這

2、些現(xiàn)象提示，TET參與的5-hmC對(duì)DNA的表觀調(diào)控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在本課題中，我們主要研究 TET1對(duì)胃癌生物學(xué)行為的影響，同時(shí)進(jìn)一步研究 TET1對(duì)胃癌相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：本研究中，我們使用免疫組化(IHC)，Western blot，Dot blot檢測(cè)胃癌組織及細(xì)胞內(nèi)TET1蛋白和5-hmC的含量。使用卡方檢驗(yàn)分析了TET1的表達(dá)與胃癌臨床病理數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。使用TET1 shRNA和TE

3、T1過表達(dá)質(zhì)粒在胃癌細(xì)胞系中敲低和過表達(dá)TET1，后續(xù)使用CCK-8，劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察TET1對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。使用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)了TET1相關(guān)靶基因的表達(dá)量，并對(duì)這些潛在的靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域使用亞硫酸氫鹽測(cè)序 PCR（BSP）來(lái)檢測(cè)甲基化的程度。后續(xù)我們使用GluMS-PCR檢測(cè)了相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的5-hmC的含量。在本研究中，我們還使用了Western blot檢測(cè)了TET1敲低和過

4、表達(dá)后AKT和FAK通路的活化狀態(tài)，以明確TET1對(duì)胃癌細(xì)胞的影響是通過何種途徑發(fā)揮作用的。在實(shí)驗(yàn)的最后，我們使用裸鼠皮下成瘤和腹膜轉(zhuǎn)移模型來(lái)說明 TET1敲低后在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中增加了胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)果：（1）我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于癌旁組組織，TET1的表達(dá)在胃癌組織中明顯降低（Wilcoxon檢驗(yàn) p=0.036），同時(shí)基因組的羥甲基化的水平在腫瘤組織中也明顯下降；（2）Kaplan-meier分析顯示TET1高表達(dá)的胃癌患者

5、的生存要優(yōu)于TET1低表達(dá)的患者（p<0.01）。（3）在胃癌細(xì)胞系NCI-N87中敲低TET1可以通過CCK-8實(shí)驗(yàn)明顯地觀察到胃癌細(xì)胞的增殖（p<0.05），同時(shí)遷移和侵襲能力也增強(qiáng)（p<0.01）。而在 SGC7901中過表達(dá) TET1可以明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖（p<0.05）和轉(zhuǎn)移能力（p<0.01）；（4）TET1可以引起經(jīng)典的胃癌相關(guān)基因如PTEN啟動(dòng)子區(qū)域羥甲基化和甲基化的改變，TET1在NCI-N87中敲低后，PTEN啟動(dòng)

6、子區(qū)域甲基化從1.5%升高到12%，而TET1在SGC7901中過表達(dá)之后，PTEN啟動(dòng)子區(qū)域甲基化從3%下降到0.9%。通過ChIP我們證明了TET1可以結(jié)合至PTEN的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)ζ溥M(jìn)行調(diào)控。（5）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于對(duì)照組，TET1敲低的胃癌細(xì)胞形成的腫瘤體積更大，重量更重（p<0.05）。同時(shí)相對(duì)于對(duì)照組，TET1敲低的胃癌細(xì)胞在裸鼠腹腔內(nèi)形成了更多的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（p<0.01）。
　　結(jié)論：通過本研究，我們發(fā)現(xiàn) TET1在胃