DAPK基因在急性髓系白血病細(xì)胞HL-60中的表達(dá).pdf

1、目的:觀察不同濃度甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮-2’-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycitydine,5-aza-2dC)對(duì)人急性髓系白血病(acute myeloidleukemia,AML)細(xì)胞系HL-60細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及對(duì)死亡蛋白相關(guān)激酶(death associated protein kinase,DAPK)基因表達(dá)的影響,探討5-aza-2dC治療AML的作用機(jī)制,為AML發(fā)病機(jī)制研究及臨床應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑治療

2、白血病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:1.采用HL-60細(xì)胞株作為白血病模型。2.分組及干預(yù):實(shí)驗(yàn)共設(shè)七組,實(shí)驗(yàn)組加入終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2umol／L的5-aza-2dC,以不加藥物組為對(duì)照組。每組設(shè)三個(gè)重復(fù)孔,采用腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)72h。3.采用MTT比色法觀察5-aza-2dC對(duì)HL-60細(xì)胞增殖活性的影響。4.采用瑞式染色法鑒定細(xì)胞及觀察5-aza-2dC對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)

3、的影響。5.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度5-aza-2dC對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡發(fā)生的影響。6.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法觀察不同濃度5-aza-2dC處理后HL-60細(xì)胞DAPK mRNA的表達(dá)情況:6.1培養(yǎng)72h后分別提取各組細(xì)胞總RNA,用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA分子的完整性。6.2通過(guò)隨機(jī)引物將各組總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(Fluorescence Quantitative Real

4、TimePolymerize Chain Reaction,FQ-RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)凋亡過(guò)程中各組細(xì)胞DAPK基因的表達(dá)。6.3隨機(jī)抽取逆轉(zhuǎn)錄的DAPK基因進(jìn)行電泳分別獲得電泳圖。將DAPK基因cDNA和ACTB基因陽(yáng)性產(chǎn)物cDNA梯度稀釋制作各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)各個(gè)樣本循環(huán)指數(shù)增長(zhǎng)期的起始點(diǎn)即循環(huán)域值(cyclethreshold,Ct)和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算各自樣本起始cDNA模板量倍數(shù)值,以ACTB基因作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)化。6.4 D

5、APK基因相對(duì)表達(dá)量:用DNA相對(duì)拷貝數(shù)和RNA表達(dá)相對(duì)量(2-ΔΔCt)表示DAPK基因相對(duì)表達(dá)量。7.統(tǒng)計(jì)方法:所有數(shù)據(jù)資料均用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示。進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),ONE-WAY AONVA方差分析,組間均數(shù)兩兩比較用LSD法。用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,5-aza-2dC呈濃度依賴性地抑制HL-60的增殖。2.瑞氏染色證明所培養(yǎng)

6、細(xì)胞是粒細(xì)胞,隨著藥物濃度增加凋亡細(xì)胞愈為明顯,在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞體積變小、胞漿量減少、核固縮、核碎裂、染色質(zhì)向核膜靠近等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化,部分細(xì)胞胞膜有偽足樣突起、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,5-aza-2dC對(duì)HL-60細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用呈濃度依賴性增強(qiáng),與對(duì)照組相比,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.RT-PCR結(jié)果顯示,對(duì)照組HL-60細(xì)胞有表達(dá)DAPK基因；隨著5-aza-2dC濃度增

7、加,HL-60細(xì)胞中DAPK基因mRNA表達(dá)趨勢(shì)逐漸增高,與對(duì)照組相比,5-aza-2dC達(dá)到一定作用濃度后被處理的細(xì)胞開始出現(xiàn)DAPK基因差異表達(dá)。
　　 結(jié)論:15-aza-2dC呈濃度依賴性地誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。2 HL-60細(xì)胞有表達(dá)DAPK基因,5-aza-2dC處理后HL-60細(xì)胞DAPK基因表達(dá)水平有增高趨勢(shì),且具有一定的濃度依賴性。3隨著5-aza-2dC濃度的增加,HL-60細(xì)胞凋亡的發(fā)生及DAPK基因的表