兔出血癥病毒亞基因組在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、兔病毒性出血癥（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗稱“兔瘟”，是由兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一種急性、烈性、致死性傳染病。兔出血癥病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是由ORF1編碼的聚合多肽裂解而來，分子量約為60ku,又被稱為 VP60蛋白，該蛋白是兔出血癥病毒最重要的免疫原蛋白。除了 VP60，RHDV基因組還編碼一種分子量約為10ku的次級結(jié)構(gòu)蛋白

2、，又稱為VP10蛋白。研究證實(shí)，在RHDV感染細(xì)胞中除了基因組RNA外，還存在大量的亞基因組mRNA，它們的翻譯產(chǎn)物是病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重要來源。大量研究資料表明，RHDV基因組（包括亞基因組）的非編碼區(qū)對病毒蛋白的翻譯與表達(dá)具有重要調(diào)節(jié)作用，此外VP10的表達(dá)對于VP60的表達(dá)和組裝還具有促進(jìn)作用。鑒于此，本研究擬利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)RHDV的亞基因組mRNA,期望在非編碼區(qū)和VP10的扶助下，高水平表達(dá)兔出血癥病毒的VP6

3、0蛋白，解決單一表達(dá)VP60產(chǎn)量偏低的問題，為下一步研發(fā)抗RHDV感染的多肽疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　首先，我們分別構(gòu)建了 pFast-sgRHDV(RHDV亞基組 mRNA）和pFast-sgRHDV?Vp10（缺失VP10編碼區(qū)的RHDV亞基組mRNA）重組載體，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選獲得穿梭質(zhì)粒Bacmid-sgRHDV和Bacmid-sgRHDV?Vp10，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩種穿梭質(zhì)粒都可以在Sf9細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，并產(chǎn)生細(xì)胞病變。W

4、estern blot檢測結(jié)果證實(shí)，含有完整亞基組 mRNA基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，VP60蛋白的表達(dá)量遠(yuǎn)高于缺失VP10亞基組mRNA表達(dá)染細(xì)胞后VP60蛋白表達(dá)量，這一方面證明亞基因組在昆蟲細(xì)胞中能夠高水平表達(dá)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，另一方面也證明VP10確實(shí)對VP60的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。
　　電子顯微鏡檢測結(jié)果證實(shí)，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的RHDV結(jié)構(gòu)蛋白VP60能夠自聚形成病毒樣顆粒（virus like particles，VLPs

5、）。由于VLPs類似完整的RHD病毒粒子，能夠模擬病毒激發(fā)宿主的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性抗體，同時(shí)又因?yàn)椴缓胁《净蚪M而十分安全。因此，病毒樣顆粒是研發(fā)多肽疫苗的最佳候選免疫原。本文即將昆蟲細(xì)胞表達(dá)的RHDV VLPs免疫試驗(yàn)兔，然后檢測它誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用VLPs免疫兔子后，不但可以激發(fā)高水平的體液免疫，而且可誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫。我們使用RHDV強(qiáng)毒對試驗(yàn)兔進(jìn)行攻擊，發(fā)現(xiàn)所有免疫兔均得到良好的保護(hù)。
　　本試驗(yàn)為