玉米S-CMS育性相關(guān)基因片段orf77、orf17的轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證.pdf

1、玉米是三種主要農(nóng)作物之一，研究玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育具有重要的意義。 將玉米S-CMS育性相關(guān)基因orf77及orf77的體外定點(diǎn)誘變產(chǎn)物orf17分別轉(zhuǎn)入到玉米、水稻、擬南芥中，所用質(zhì)粒載體是pCAMBIA1303，在orf77、orf17的前面連上一段線粒體靶向序列(ATPsynthasesubunitbeta的前導(dǎo)序列)，將合成的蛋白導(dǎo)入到線粒體，所用的啟動(dòng)子是玉米中的zm13花粉特異性的啟動(dòng)子。 采用基因槍和農(nóng)桿菌浸

2、染兩種方法分別轉(zhuǎn)化玉米，潮霉素篩選壓為25mg/L，農(nóng)桿菌菌株是LBA4404。使用農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化水稻，所用農(nóng)桿菌菌株是EHA105，潮霉素篩選壓是50mg/L。擬南芥采用農(nóng)桿菌花序浸染法，所用農(nóng)桿菌菌株是GV3101，潮霉素篩選壓是50mg/L。 玉米轉(zhuǎn)化未得到成活的陽性轉(zhuǎn)基因苗，分析原因可能是篩選標(biāo)記潮霉素對(duì)玉米進(jìn)行篩選效果不顯著；受體材料質(zhì)量不佳，愈傷組織分化率低，轉(zhuǎn)化率低。水稻和擬南芥的轉(zhuǎn)化中均得到了轉(zhuǎn)基因植株。

3、 T0代的水稻和擬南芥中，花粉的育性受到了影響，導(dǎo)致了花粉的部分不育，可能是orf77、orf17的轉(zhuǎn)入導(dǎo)致的，但也可能是轉(zhuǎn)基因和組培過程所導(dǎo)致的。T1代的水稻和擬南芥中，orf77、orf17基因都發(fā)生了分離，但不論有無orf77、orf17的存在，T1代花粉的育性全部都表現(xiàn)正常，沒有導(dǎo)致雄性不育。從轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)orf77、orf17是否發(fā)生轉(zhuǎn)錄，結(jié)果表明orf77、orf17在花粉內(nèi)均進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。DNA水平上檢測(cè)orf77、or

4、f17已轉(zhuǎn)入，RNA水平上檢測(cè)orf77、orf17也發(fā)生轉(zhuǎn)錄，但轉(zhuǎn)基因水稻和擬南芥的育性卻不受影響，分析原因可能是：orf77是玉米的雄性不育基因，orf17是玉米雄性不育基因orf77的編輯產(chǎn)物，由于物種間的差異，orf77、orf17可能不能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻、擬南芥的雄性不育；ORF77、ORF17蛋白的表達(dá)量不夠，不能夠?qū)е罗D(zhuǎn)基因植株的雄性不育；線粒體靶向序列可能存在問題，未能將ORF77、ORF17蛋白導(dǎo)入線粒體，所以不能發(fā)揮功