桿狀病毒AcMNPV orf18基因的研究.pdf

1、苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)開放閱讀框18(ac18)是桿狀病毒中一個(gè)較為保守但功能未知的基因。本文通過同源重組將ac18基因從AcMNPV基因組中缺失，研究了ac18基因缺失對(duì)病毒在離體培養(yǎng)細(xì)胞和蟲體中增殖的影響，同時(shí)對(duì)ac18基因轉(zhuǎn)錄特征、Ac18蛋白的亞細(xì)胞定位等進(jìn)行了研究。 ac18位于病毒基因組nt14

2、,398-nt15,459，全長(zhǎng)1,062bp，編碼353個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)編碼蛋白的分子量為40.865KDa。序列分析表明，Ac18所有的同源蛋白僅存在于大多數(shù)以鱗翅目昆蟲為宿主的桿狀病毒科核多角體病毒屬中，氨基酸序列一致性介于21-99﹪之間。氨基酸序列結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，Ac18中有一個(gè)類細(xì)胞周期蛋白結(jié)構(gòu)域(cyclin-like domain)，暗示其屬于類細(xì)胞周期蛋白。細(xì)胞周期蛋白是真核細(xì)胞周期循環(huán)中的主要調(diào)控因子，其周期性積累

3、與分解對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程起重要調(diào)控作用。 AcMNPV感染草地貪夜蛾細(xì)胞(Sf-9)后2至96小時(shí)，RT-PCR法均可檢測(cè)到ac18的轉(zhuǎn)錄本；5′-RACE分析結(jié)果表明ac18基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(nt15,502)位于ATG上游47nt的桿狀病毒非典型早期啟動(dòng)子模序CGTGC的第一個(gè)C，推測(cè)ac18基因是一個(gè)早期基因。 為了研究ac18在病毒侵染過程中的生物學(xué)功能，本研究利用ET-重組的方法在大腸桿菌DH10B細(xì)胞中將AcM

4、NPV Bacmid基因組中的ac18基因片段敲除，構(gòu)建了缺失ac18基因的重組病毒。利用位點(diǎn)特異性重組技術(shù)將ac18轉(zhuǎn)座入 AcMNPV Bacmid的polyhedrin位點(diǎn)，構(gòu)建了ac18基因補(bǔ)回型重組病毒。將經(jīng)過轉(zhuǎn)座帶有綠色熒光蛋白基因(green fluorescence protein，gfp)和多角體基因(polh)的野生型病毒、ac18缺失型病毒和ac18補(bǔ)回型病毒分別轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞上清中病毒滴度的檢測(cè)表明三

5、種病毒的復(fù)制增殖沒有明顯差異；用所產(chǎn)生的子代芽生型病毒(budded virus，BV)以相同侵染復(fù)數(shù)分別感染Sf-9細(xì)胞，病毒滴度測(cè)定分析表明三種病毒的生長(zhǎng)曲線不存在明顯差異。透射電鏡觀察結(jié)果表明，ac18缺失型病毒感染Sf-9細(xì)胞能產(chǎn)生與野生型病毒形態(tài)一致的芽生型病毒和包埋型病毒(occlusion-derived virus,，ODV)。以上研究結(jié)果表明，ac18是AcMNPV在Sf-9細(xì)胞中增殖的非必需基因。用等量的野生型病毒和

6、ac18缺失型病毒Bacmid DNA共轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞并進(jìn)行無(wú)稀釋傳代，再用點(diǎn)雜交(Dot Blot)方法分析了1-7代細(xì)胞中兩種病毒DNA含量，發(fā)現(xiàn)其所占比例無(wú)穩(wěn)定變化趨勢(shì)，表明ac18的有無(wú)不賦予病毒在Sf-9細(xì)胞中的任何生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。野生型病毒和ac18缺失型病毒對(duì)粉紋夜蛾(Trichoplusia，ni)三齡幼蟲的生物測(cè)定發(fā)現(xiàn)，同野生型病毒相比，ac18缺失型病毒的半致死劑量(50﹪lethal dose，LD<,50>)沒有顯著

7、差異，但半致死時(shí)間(50﹪lethal time，LT<,50>)卻延長(zhǎng)了22小時(shí)，說明ac18基因的缺失不影響病毒口服感染能力，但降低了殺蟲速度，推測(cè)Ac18可能與病毒在粉紋夜蛾中的復(fù)制速度有關(guān)。 為了研究Ac18蛋白的亞細(xì)胞定位，我們構(gòu)建了ac18基因啟動(dòng)子控制的表達(dá)Ac18與GFP融合蛋白的重組病毒vAc<'Ac18GFP>。通過檢測(cè)vAc<'Ac18GFP>感染Sf-9細(xì)胞中綠色熒光的分布，示蹤Ac18在感染細(xì)胞的位置變