虎紋蛙病毒毒力相關(guān)ORF10、凋亡相關(guān)ORF80的研究.pdf

1、虎紋蛙病毒(tiger frog virus，TFV)是虹彩病毒的一種，也是養(yǎng)殖虎紋蛙蝌蚪和中華鱉發(fā)病致死的主要病原之一，本實(shí)驗(yàn)在已完成虎紋蛙病毒的全基因組測序的基礎(chǔ)上，對其ORF10和ORF80蛋白進(jìn)行相互作用蛋白相關(guān)、凋亡相關(guān)以及毒力相關(guān)方面進(jìn)行了研究。 本試驗(yàn)先從虎紋蛙病毒各基因的生物信息學(xué)分析以及實(shí)驗(yàn)室已有基礎(chǔ)入手，篩選出虎紋蛙病毒的orf10與orf80基因作為研究對象。據(jù)核苷酸和蛋白質(zhì)序列比對分析，ORF10沒有任何

2、同源的相似序列和保守結(jié)構(gòu)域，而且根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室初步的基因芯片分析與半定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)其基因在TFV感染宿主后有大量表達(dá)；而ORF80蛋白則含有一個與脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子a因子(LPSinduced TNF-a factor，LITAF)膜結(jié)合基序非常相似的結(jié)構(gòu)域，即N端的CXXC結(jié)構(gòu)域，中間由幾十個氨基酸所組成的長的疏水區(qū)再加上C端的(H)XCXXC結(jié)構(gòu)域。為進(jìn)行蛋白相互作用方面的研究，將orf10和orf80基因克隆至原核表

3、達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)和純化，成功制備了抗ORF80蛋白的小鼠抗體，通過蛋白沉降、免疫沉淀和Far-Western Blot等方法檢測了與TFV ORF80蛋白相互作用的蛋白。為了研究這兩個基因?qū)?xì)胞凋亡的影響，將兩基因克隆至真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至 FHM(fathead minnow)細(xì)胞，通過凋亡染色與細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示ORF80蛋白的單獨(dú)表達(dá)會導(dǎo)致比較明顯的宿主細(xì)胞凋亡，而ORF10則不會引起細(xì)胞凋亡，這說明ORF80與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)產(chǎn)生

4、相關(guān)。為了鑒定兩基因的表達(dá)對TFV毒力的影響，在FHM細(xì)胞中進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染針對兩基因的特異的siRNA后進(jìn)行TFV感染，發(fā)現(xiàn)ORF10被抑制后能夠明顯抑制TFV引發(fā)的細(xì)胞病理變化，而ORF80被抑制則沒有這種效果，說明orf10基因是TFV毒力相關(guān)的重要基因。本文通過相互作用蛋白篩選、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的鑒定以及毒力相關(guān)RNA干擾抑制的鑒定三個方面對TFV ORF10和ORF80的功能進(jìn)行了初步研究，為。TFV侵染過程中引起的細(xì)胞凋