百令膠囊對放射性肺損傷防護(hù)作用的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、目的:
　　 放射性治療(radioactive therapy，RT)是肺癌、乳腺癌、食管癌等胸部腫瘤患者最主要的治療手段之一。肺是人體中輻射較為敏感的器官，放射治療可使靠近腫瘤周圍的肺組織受到超過其生物效應(yīng)閾值的放射線劑量而導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞損傷。放射性肺損傷(radio-pulmonary lesion，RPI)是胸部腫瘤放射治療最為常見并發(fā)癥之一，臨床上通常有兩種表現(xiàn)形式，早期急性放射性肺炎和后期放射性肺纖維化[1]。放

2、射性肺損傷限制了腫瘤的放療劑量，也使放療效果大大降低，其發(fā)病機制尚不清楚，且缺乏有效的預(yù)測指標(biāo)，已成為有效治療胸部腫瘤的一大難題。一旦發(fā)生放射性肺損傷，目前臨床上最常用的治療方法是使用腎上腺皮質(zhì)激素聯(lián)合抗生素[2]。雖然大劑量激素可暫時有效緩解癥狀，抑制肺纖維化的發(fā)展，但容易產(chǎn)生諸多并發(fā)癥。放射性肺損傷嚴(yán)格意義上來講是無菌性炎癥[3]，其一旦發(fā)生往往不可逆轉(zhuǎn)，因此預(yù)防比治療更重要。近年研究表明放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展是一個有多種細(xì)胞參與，

3、多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)相互作用發(fā)生的復(fù)雜生物分子過程[4]。由于其病理機制的多環(huán)節(jié)及復(fù)雜性，單一環(huán)節(jié)或靶向的干預(yù)效果尚不理想，臨床上仍然缺乏防治放射性肺損傷的特異有效藥物。阿米福叮(amifostine，AMSF)是目前公認(rèn)的世界上唯一比較成熟應(yīng)用于臨床的放射性肺損傷防護(hù)劑[5][6]。遺憾的是，阿米福叮價格昂貴，很少患者能夠負(fù)擔(dān)，而且可能存在較大毒副作用[7][8]，臨床上難以廣泛應(yīng)用。因此，尋找更為高效、低毒、經(jīng)濟(jì)的放射性肺損傷防護(hù)

4、劑就顯得愈加重要了。中醫(yī)藥是我國的傳統(tǒng)瑰寶，中藥具有整體調(diào)節(jié)，多成分與多環(huán)節(jié)的作用特點，對病理復(fù)雜的疾病可發(fā)揮綜合優(yōu)勢，研究及實踐證明中醫(yī)藥在放射性肺損傷具有良好作用與發(fā)展前景[9][10]。大量的臨床研究表明[11][12][13]，中醫(yī)藥防治放射性肺炎及肺纖維化療效確切，能有效改善患者的臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，降低死亡率，因此探討中醫(yī)藥防治放射性肺損傷具有十分重要的現(xiàn)實意義。百令膠囊(Bailing Capsule，BC)是人工培養(yǎng)

5、的冬蟲夏草菌絲，經(jīng)生物工程方法制成的中藥制劑，它與天然蟲草的化學(xué)組成與功效基本一致，幾十年來的研究已經(jīng)證實，百令膠囊在調(diào)節(jié)機體免疫、抗腫瘤、抗輻射等方面發(fā)揮了一定的作用[14]，研究證實，百令膠囊能顯著降低纖維化的重要細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β），對改善腎臟及肝臟纖維化方面有一定療效[15][16][17]。目前尚未發(fā)現(xiàn)百令膠囊防治放射性肺損傷的作用機制研究的報道。本課題

6、分兩部分，第一部分為觀察百令膠囊防治放射性肺損傷大鼠模型的基礎(chǔ)研究。首先復(fù)制放射性肺損傷的大鼠模型，以促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子和促纖維化細(xì)胞因子為切入點，從放射性肺炎及肺纖維化的基礎(chǔ)證候著手，以百令膠囊作為養(yǎng)陰清肺的基本藥方，觀察百令膠囊對大鼠肺系數(shù)、肺組織病理形態(tài)的影響;對大鼠肺組織超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的影響;對大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶(

7、MatrixMetalloproteinase-2，MMP-2)及其組織抑制劑(Tissue Inhibitor of MatrixMetalloproteinases-2，TIMP-2)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響;尤其是對大鼠血漿促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)及促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1的影響。第二部分為觀察百令膠囊對胸部腫瘤患者

8、放射性肺損傷的臨床研究。通過觀察胸部腫瘤患者的放射性肺炎發(fā)生率、臨床癥狀積分、生活質(zhì)量及血漿TGF-β1水平以評價百令膠囊對放射性肺損傷的防治效果，為進(jìn)一步尋找防治放射性肺損傷相關(guān)靶點，探求其可能的作用機制并為臨床使用提供確切可行的科學(xué)依據(jù)。如果能夠證實百令膠囊確實具有放射性肺損傷防護(hù)劑之功效，那么對開發(fā)適合我國國情的輻射防護(hù)劑將具有重要意義，對腫瘤放射治療學(xué)的發(fā)展乃至核工業(yè)的發(fā)展，都將起到積極的推動作用。
　　 方法:

9、　　 第一部分（基礎(chǔ)研究）:將141只6周齡清潔級雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組（對照組）、單純放射模型組（模型組）、百令膠囊預(yù)防組（百令預(yù)防組）、百令膠囊治療組（百令治療組）、地塞米松治療組（地塞米松組），其中正常對照組21只，其它各組均為30只。各組均給予X射線全胸單次照射20Gy，正常對照組除外。百令膠囊用生理鹽水溶解成一定濃度混懸液。正常對照組、模型組于造模后第二天起予等容積的生理鹽水灌胃，百令治療組灌服百令膠囊混懸液，地塞

10、米松組予灌服地塞米松混懸液，每日1次。百令預(yù)防組則于照射前2周起開始灌服百令膠囊混懸液。每組分別于2、4、6周不同時間點隨機處死大鼠，正常對照組每組7只，其它各組均為10只，腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉大鼠，心臟采血5ml，置肝素抗凝管，4℃3000r/min離心10min，分離血漿，置-20℃冰箱保存待用。采集大鼠肺組織，稱重，計算肺系數(shù)的變化;HE染色、Masson染色光鏡下觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，采用黃嘌呤氧化酶法測定SO

11、D活性，采用硫代巴比妥酸化學(xué)比色法測定MDA含量，ELISA法檢測大鼠血漿TNF-α、IL-6及TGF-β1含量的變化，免疫組化法觀察大鼠肺組織MMP-2，TIMP-2蛋白表達(dá)的變化。
　　 第二部分（臨床研究）:觀察了從2012年1月至2012年8月來源于贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科接受胸部腫瘤放射治療的患者，共觀察38例，隨機分為兩組，百令膠囊組(19例):放射同時服用百令膠囊，從放療第一天開始服用，按500mg/kg，口服

12、，分3次/日，連續(xù)服至放療結(jié)束后一個月。對照組(19例):單純放療。觀察放射性肺炎發(fā)生率、中醫(yī)臨床癥狀積分評定、生活質(zhì)量及TGF-β1水平等指標(biāo)。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分（基礎(chǔ)研究）:
　　 (1)在照射后1周至4周各組呈現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)，其中10Gy、15Gy、20Gy組大鼠全部存活，25Gy組大鼠在照射后2周內(nèi)相繼死亡。結(jié)合觀察大鼠的一般狀態(tài)，以20Gy最為典型，提示能在較短時間內(nèi)成功復(fù)制大鼠放射性肺損傷

13、模型最佳照射劑量為20Gy，為今后研究中醫(yī)藥防治放射性肺損傷的作用機制及防治藥物的篩選最佳照射劑量提供了實驗基礎(chǔ)。
　　 (2)百令膠囊可顯著降低放射性肺炎大鼠肺系數(shù)(P＜0.01)。其中百令預(yù)防組作用優(yōu)于百令治療組。百令預(yù)防組、百令治療組、地塞米松組各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。肺組織病理學(xué)形態(tài)觀察表明，第2、4、6周，百令預(yù)防組、百令治療組與模型組比較，肺泡充血、滲出、出血及炎性細(xì)胞侵潤等方面程度較輕;百令治療

14、組、百令預(yù)防組與地塞米松組比較，炎性程度明顯較輕;第2周地塞米松組肺泡隔充血，出血與模型組比較無差別，但炎性細(xì)胞浸潤相對較輕，
　　 4、6周差別不明顯。
　　 (3)百令預(yù)防組、百令治療組、地塞米松組2、4、6周大鼠肺組織中SOD活性均高于模型組(P＜0.01)，MDA含量均低于模型組(P＜0.01)。其中，百令預(yù)防組SOD活性高于百令治療組、地塞米松治療組(P＜0.01)。百令治療組高于地塞米松組(P＜0.05)。:

15、百令預(yù)防組MDA含量低于百令治療組、地塞米松治療組(P＜0.01)，百令治療組低于地塞米松組(P＜0.05)。
　　 (4)百令預(yù)防組、百令治療組、地塞米松組2、4、6周大鼠血漿中TNF-α、IL-6及TGF-β1低于模型組(P＜0.01或P＜0.05)。其中，百令預(yù)防組TNF-α、IL-6及TGF-β1低于百令治療組、地塞米松組(P＜0.01)，百令治療組TYF-α、IL-6及TGF-β1低于地塞米松組(P＜0.01)。

16、>　　 (5)百令預(yù)防組2、4、6周各時間點大鼠肺組織中MMP-2表達(dá)均低于模型組(P＜0.01);百令治療組均低于模型組(2周P＜0.01;4、6周P＜0.05)。地塞米松治療組各時間點與模型組比較差異不明顯(P＞0.05)。百令預(yù)防組大鼠肺組織中MMP-2表達(dá)2、4周明顯低于百令治療組（2周P＜0.05，4周P＜0.01），6周差異不顯著(P＞0.05)。百令預(yù)防組各時間點與地塞米松治療組比較均有顯著差異(2、4周P＜0.01，6

17、周P＜0.05)。百令治療組大鼠MMP-2的表達(dá)2周低于地塞米松治療組(P＜0.05)，但4、6周差異不明顯(P＞0.05)。百令預(yù)防組大鼠肺組織中TIMP-2表達(dá)量明顯低于模型組(2周P＜0.05，4、6周P＜0.01)。百令預(yù)防組與模型組比較TIMP-2表達(dá)2、4周下降不顯著(P＞0.05)、第6周差異顯著(P＜0.05)。地塞米松治療組各時間點與模型組比較均無顯著差異(P＞0.05)。百令預(yù)防組2周與百令治療組比較差異不明顯(P＞

18、0.05)，4、6周百令預(yù)防組明顯低于百令治療組(4周P＜0.05，6周P＜0.01)。百令預(yù)防組2周與地塞米松治療組比較無明顯差異((P＞0.05)，4、6周明顯低于地塞米松治療組組(P＜0.01)。百令治療組4周與地塞米松治療組比較無明顯差異(P＞0.05)，6周百令治療組低于地塞米松治療組(P＜0.05)。
　　 第二部分（臨床研究）:
　　 (1)在放射性肺炎發(fā)生率方面，胸部腫瘤放療患者放療結(jié)束6周后，百令組放射

19、性肺炎的總發(fā)生率顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　 (2)在中醫(yī)臨床癥狀積分評定方面，百令組治療咳嗽、咳痰、痰中帶血、胸悶氣短、胸痛和五心煩熱等癥狀方面，在治療后3周和6周后較第1周顯著改善，(P＜0.05);百令組在放射后第3周相與對照組比較，在咳嗽、咳痰、痰中帶血、胸悶氣短、胸痛較其有顯著改善(P＜0.05);在放射后第6周相與對照組比較，在咳嗽、咳痰、痰中帶血、胸悶氣短較其有顯著改善(P＜0.01)。
　　 (

20、3)在生活質(zhì)量評定方面，百令組在生活質(zhì)量的改善、穩(wěn)定方面均高于對照組，生活質(zhì)量降低低于對照組，百令組有效率高于對照組，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 (4)在放療患者血漿TGF-β1水平比較方面，百令組胸部放療患者血漿TGF-β1水平顯著低于對照組，(P＜0.01)，放療6周時血漿TGF-β1水平顯著低于對照組，(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 第一部分（基礎(chǔ)研究）:
　　 (1)本實驗提示制

21、作肺損傷模型最佳照射劑量為20Gy。
　　 (2)百令膠囊對放射性肺損傷大鼠有一定的防治效果。其防治作用可能通過以下途徑實現(xiàn):a、增強大鼠肺組織SOD的活性，減少MDA含量;b、抑制血漿促炎癥因子IL-6、TNF-α及和促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1的釋放;c、降低放射性肺損傷大鼠肺組織MMP-2、TIMP-2蛋白質(zhì)表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2的平衡。百令膠囊能從不同程度上抑制或減輕肺泡的炎性反應(yīng)，并能抑制肺纖維化的進(jìn)程，從