全基因組外顯子測序?qū)Ψ西[癌的新的基因突變篩查研究.pdf

1、目的：通過新一代測序技術(shù)，研究非小細胞肺癌的主要組織類型之一鱗癌的全基因組水平上基因變異，以期發(fā)現(xiàn)新的致病性基因結(jié)構(gòu)異常，加深人們對肺鱗癌發(fā)病的分子機理的理解，并為進一步研發(fā)新的治療途徑提供可能的分子靶點。
　　方法：收集手術(shù)或活檢診斷明確的非小細胞肺癌（NSCLC）患者的肺癌組織和癌旁組織，以及枸櫞酸抗凝的外周血5ml。選擇一例典型的長期吸煙男性患者，手術(shù)病理確診的鱗癌組織及癌旁正常肺組織的 DNA，用二代測序技術(shù)，通過全基因組

2、外顯子捕獲，獲得其全部外顯子，用IlluminaII測序平臺，讀取其DNA序列；經(jīng)生物信息學（bioinformatics）分析，和人類基因組的參考序列hg19（Human Genome19）比對，識別外顯子上堿基的變異，進一步與配對的癌旁正常肺組織DNA序列比對，并與單核苷酸多態(tài)性（SNP）數(shù)據(jù)庫比對，排除單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），從而獲得腫瘤組織內(nèi)各種體細胞突變（soma

3、tic mutation)的信息，包括單堿基突變（single nucleotide variation，SNV)、小片段的插入與缺失（indels）這兩種類型的體細胞突變。進一步，對發(fā)現(xiàn)的SNV進行分析，識別出改變氨基酸結(jié)構(gòu)的SNV即非同義突變（non-synonymous mutations）,包括氨基酸替代突變即錯義突變（missense mutation）和氨基酸鏈提前終止的突變即無義突變（non-sense mutation)

4、，以及在蛋白編碼區(qū)域內(nèi)的導致氨基酸移碼突變（shift-frame mutation）的Indel變異。并進一步對這些可能改變蛋白功能的突變，通過一代測序方法驗證所有的非同義體細胞突變，確定發(fā)現(xiàn)的突變的可靠性。最后，通過生物信息學手段，結(jié)合挑選可能的肺癌致病候選基因，在擴大的肺癌樣本中，進行突變檢測，以期發(fā)現(xiàn)新的肺癌致病基因。
　　結(jié)果：通過全基因組外顯子捕獲技術(shù)，獲得了一例非鱗癌病人的肺癌組織和其癌旁組織內(nèi)覆蓋全部外顯子的3.4

5、M個堿基（3.4Mbp）的基因組序列，其中約71％的序列是蛋白質(zhì)編碼區(qū)（coding sequence，CDS）。GAIIx測序程序獲得原始數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學分析，在該例肺鱗癌病人的肺癌組織的體細胞中，共發(fā)現(xiàn)了92個改變氨基酸結(jié)構(gòu)的非同義突變，包括81個單核苷酸替代突變經(jīng)一代測序驗證，發(fā)現(xiàn)77個突變是真實的肺癌組織內(nèi)的體細胞突變，和11 indel突變經(jīng)驗證10個是真正的突變。通過擴大樣本并結(jié)合生物信息學方法的驗證，我們發(fā)現(xiàn)在識別的87個

6、改變氨基酸突變的基因中，除一個基因外，其它基因均在一例以上的實體瘤組織中發(fā)生了體細胞的突變。其中有17個基因在不同類型的肺癌組織中發(fā)生了體細胞的突變。在17個基因中有7個基因在其它實體瘤或肺癌組織中的突變頻率接近或超過10%，這7個基因分別為SPEN，LPHN2，TP53，MYH2，TGM2，DIAPH2和LZTR1基因。在這17個基因中，位于10號染色體的C10orf137基因和11號染色體上的MS4A3基因，在其它的肺癌組織中的突變

7、位點和我們發(fā)現(xiàn)的這例肺鱗癌樣本中的突變位點相同，且這兩個基因在其它實體瘤組織中突變頻率也接近或超過5%,這些結(jié)果提示這兩個基因也可能是新的腫瘤致病基因。另外，我們還首次發(fā)現(xiàn)，有3個參與葡萄糖酵解的基因PKLR，PDK1和 ALDOB發(fā)生突變，可能對腫瘤形成有重要作用。
　　結(jié)論：全外顯子測序是能夠發(fā)現(xiàn)肺癌新的致病性基因突變的有效措施。我們的研究提示有9個基因，SPEN，LPHN2，TP53，MYH2，TGM2，DIAPH2，LZT