基于全基因組外顯子測序技術進行散發(fā)性結直腸癌候選基因DDI2的功能實驗研究.pdf

1、近年來，隨著我國經濟的快速發(fā)展以及生活習慣的改變，散發(fā)性結直腸癌(sporadic colorectal cancer，sCRC)的發(fā)病和死亡人數也在不斷上升，目前已經成為嚴重危害人類健康的一類惡性腫瘤。根據國內外研究發(fā)現KRAS、P16和TP53等基因發(fā)生改變與結直腸癌的發(fā)生息息相關，但仍有30％的結直腸癌不是由此機制導致的，因此，探索部分腫瘤中新的發(fā)生機制及結直腸癌候選基因有重要意義。全基因組外顯子測序是一種具有高靈敏性的基因組分析

2、方法，它只需要通過對基因組中1％的序列測序就可以發(fā)現大量的疾病相關變異。
　　目的:
　　本課題通過全基因組外顯子測序篩選出散發(fā)性結直腸癌的可能的候選基因DDI2(DNA-damage inducible1homolog2)，并選擇LoVo細胞進行體外基因過表達功能實驗，為后續(xù)研究打下基礎。
　　方法:
　　首先利用全基因組外顯子測序技術篩選出三例sCRC癌組織樣本中特異的功能缺失(Loss of Functio

3、n,LoF)突變基因，結合相關生物信息分析方法確定散發(fā)性結直腸癌候選基因DDI2。之后，根據前期研究結果，選擇該基因表達水平最低的結直腸癌細胞LoVo，分別轉染質粒pIRES2-EGFP，質粒pIRES2-DDI2，質粒pIRES2-DDI2mutant后，進行體外細胞實驗觀察DDI2過表達對CRC細胞生物學性狀的影響。
　　結果:
　　1)通過劃痕實驗、Transwell遷移實驗、Transwell侵襲實驗、CCK-8增殖

4、實驗、克隆形成實驗發(fā)現，DDI2野生組與轉染對應載體的對照組相比，結腸癌細胞LoVo的遷移能力、侵襲能力、增殖能力均有一定的減弱，且具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　2)通過流式細胞術檢測細胞的凋亡情況，DDI2野生組與對照組相比，結果并未發(fā)現兩組細胞的凋亡比率有顯著性差異，這說明DDI2對于LoVo細胞增殖能力的影響可能并不是通過細胞凋亡引起的。
　　3)通過CCK-8檢測5-FU在不同濃度時的細胞活性情況，發(fā)現DDI