長(zhǎng)非編碼RNA在脂肪干細(xì)胞脂向分化的差異性表達(dá)分析.pdf

1、[目的]
　　成脂分化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程的，涉及激素刺激，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因表達(dá)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，整個(gè)成脂分化是一個(gè)由許多轉(zhuǎn)錄因子參與形成的網(wǎng)絡(luò)。lncRNAs可在不同的生物進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮作用，包括細(xì)胞周期調(diào)控，免疫監(jiān)視，胚胎干細(xì)胞多能性等，然而其在成脂分化的分子機(jī)制仍未清楚。本研究通過(guò)人脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)定向脂向誘導(dǎo)分化，成功鑒定后應(yīng)用高通量篩選技術(shù)篩選出有差異表達(dá)的ln

2、cRNAs，并預(yù)測(cè)其作用的靶基因。初步建立ADSCs脂向分化中l(wèi)ncRNAs的相關(guān)調(diào)控基因、細(xì)胞因子表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)，找出lncRNAs在成脂分化過(guò)程中的啟動(dòng)機(jī)制及調(diào)控通道，為肥胖癥的基礎(chǔ)治療提供理論依據(jù)。
　　[方法]
　　組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)3例健康人的ADSCs，對(duì)第三代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀鑒定。每例細(xì)胞標(biāo)本隨機(jī)分成三組（0 d、5d和12 d），分別成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)5d和12d后進(jìn)行油紅O染色鑒定。對(duì)所有樣本進(jìn)行總RNA抽提及質(zhì)量檢

3、測(cè)。對(duì)每個(gè)樣本約5μg總RNA進(jìn)行標(biāo)記及列陣雜交，應(yīng)用Axon GenePix4000B微陣點(diǎn)掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度。掃描圖像輸入NimbleScan2.5軟件進(jìn)行網(wǎng)格定測(cè)和數(shù)據(jù)表達(dá)分析，通過(guò)分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和軟件內(nèi)置的穩(wěn)定多片平均值(RMA)對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，所有的lncRNAs被輸入到軟件Agilent GeneSpring GX11.5.1中進(jìn)行l(wèi)ncRNAs差異表達(dá)譜篩選。每個(gè)樣本重復(fù)篩選3次，將lncRNAs的所有目標(biāo)值的標(biāo)

4、準(zhǔn)化值≥100挑選出進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。最后分層聚類分析有差異表達(dá)的lncRNAs的表達(dá)模型。
　　[結(jié)果]
　　第3代ADSCs代表面抗原表達(dá)CD29，CD44，CD90，CD105表達(dá)陽(yáng)性。CD34，CD45，CD106表達(dá)陰性。第3代人脂肪干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑分別培養(yǎng)5d,12 d后用油紅O染色，計(jì)數(shù)脂滴數(shù)量，第5d和第12 d的脂肪顆粒數(shù)是5％和41％。第3代人脂肪干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后倒置相差顯微鏡下觀察，茜素紅染色陽(yáng)性

5、。總RNA抽提及質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果所有樣本A260/A280值在1.80～2.10，均符合要求。對(duì)掃描超過(guò)1800個(gè)人lncRNAs表達(dá)譜篩選，人工分析出5個(gè)3.0倍以上持續(xù)上調(diào)的lncRNAs和4個(gè)3.0倍以上持續(xù)下調(diào)的lncRNAs，其中6個(gè)有對(duì)應(yīng)的靶基因，3個(gè)沒(méi)有靶基因，只有LncRNAs所在染色體的位置和序列。
　　[結(jié)論]
　　本研究通過(guò)對(duì)人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞脂向誘導(dǎo)分化的lncRNAs篩選，得出差異性表達(dá)譜，它們可能