G四鏈體抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和血管生成的研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成PU22片段，體外研究其對(duì)VEGF基因表達(dá)、結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及血管生成的影響作用。
　　方法：
　　(1)利用生物信息學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)針對(duì)VEGF啟動(dòng)子的PU22序列，另外將PU22序列打亂設(shè)計(jì)對(duì)照序列MUTPU22，并通過(guò)基因庫(kù)比對(duì)確保其特異性。
　　(2)將帶有FITC熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈PU22加入結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞中，分析結(jié)腸癌細(xì)胞攝取寡核苷酸鏈PU22的情況。

2、>　　(3)提取用MUTPU22或不同濃度PU22處理的HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞的總RNA，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)VEGF基因 mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而找出最佳作用濃度。
　　(4)后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為3組：PU22處理的實(shí)驗(yàn)組、MUTPU22處理的對(duì)照組和未處理的空白組。
　　(5)提取結(jié)腸癌細(xì)胞總蛋白，通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)測(cè)得各組VEGF蛋白表達(dá)水平。
　　(6)采用AnnexinV-FITC

3、法通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PU22對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；利用MTT實(shí)驗(yàn)觀察各組結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖變化。
　　(7)利用HUVEC進(jìn)行體外小管形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)PU22對(duì)血管形成的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)成功篩選設(shè)計(jì)出可能作用于VEGF啟動(dòng)子區(qū)域的PU22序列(5'-CGGGGCGGGCCGGGGGCGGGGT-3')和對(duì)照序列 MUTPU22(5'-CGAGTCGCGCCGAGTGCGAGAT-3')。通過(guò)基

4、因庫(kù)比對(duì)序列具有較高的特異性。
　　(2)利用細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PU22已成功的被結(jié)腸癌細(xì)胞攝取，且攝取率高達(dá)90％。
　　(3)熒光實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480經(jīng)不同濃度PU22作用后，細(xì)胞中VEGF基因RNA的表達(dá)量皆有降低，其中濃度為8μM時(shí)作用最明顯，最佳作用時(shí)間為48小時(shí)，SW480細(xì)胞作用效果優(yōu)于HCT116細(xì)胞，其中8μMPU22作用 SW480細(xì)胞48小時(shí)后， VEGF基因 m

5、RNA表達(dá)量為0.027±0.002。結(jié)果表明PU22序列可以抑制VEGF基因mRNA的表達(dá)。
　　(4)Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)不同條件處理HCT116細(xì)胞48h后，實(shí)驗(yàn)組灰度值(0.074±0.007)明顯皆小于空白組(0.737±0.034)和對(duì)照組(0.513±0.013)，且皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；72h后實(shí)驗(yàn)組灰度值(0.252±0.094)略小于空白組(0.466±0.063)和對(duì)照組

6、(0.396±0.119)；經(jīng)過(guò)不同條件處理 SW480細(xì)胞48h后實(shí)驗(yàn)組灰度值(0.029±0.001)皆明顯小于空白組(0.572±0.127)和對(duì)照組(0.488±0.034)，且都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，72h后實(shí)驗(yàn)組灰度值(0.113±0.009)皆明顯小于空白組(0.635±0.061)和對(duì)照組(0.481±0.007)，且都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)果表明人結(jié)腸癌HCT116和SW480細(xì)胞經(jīng)不同條件作用后，細(xì)

7、胞中VEGF蛋白的表達(dá)量皆有降低，說(shuō)明設(shè)計(jì)的外源G四鏈體PU22可以抑制VEGF基因蛋白的表達(dá)。
　　(5)Annexin V-FITC法檢測(cè)各組細(xì)胞48h后的凋亡情況。結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的凋亡率(42.46%±2.03%)高于對(duì)照組(28.78%±1.87%)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。SW480細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的凋亡率(69.14%±1.77%)大于對(duì)照組(32.95%±2.18%)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.

8、05)。結(jié)果表明PU22可以誘導(dǎo)HCT116與SW480細(xì)胞凋亡。
　　(6)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：從72h起，實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸癌細(xì)胞的增值水平顯著低于空白組跟對(duì)照組，此時(shí) SW480細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組的 OD450分別為0.247±0.067、0.408±0.034、0.423±0.115；HCT116細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組的OD450分別為0.402±0.193、0.896±0.074、0.921±0.127。說(shuō)明外源G四

9、鏈體PU22可以抑制結(jié)腸癌HCT116和SW480細(xì)胞的增殖能力。
　　(7)小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PU22作用結(jié)腸癌細(xì)胞后，HCT116細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組血管的形成數(shù)分別為11.5±1.81、24.5±0.97、26±2.62；SW480細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組血管的形成數(shù)分別為8.27±2.04、21.3±1.66、21.5±0.91。實(shí)驗(yàn)組的血管生成率明顯小于對(duì)照組和空白組，且管腔不完整，說(shuō)明PU22可以抑制體外血