IK6基因特異性ShRNA慢病毒載體的構建與鑒定.pdf

1、目的：
　　采用瞬時轉染技術篩選出對IK6基因抑制效率較高的一對小干擾RNA(smallinterferingRNA,SiRNA),進而構建IK6基因短發(fā)夾狀RNA(shorthairRNA,shRNA)慢病毒載體及鑒定其沉默功能,為進一步研究IK6基因在兒童急性淋巴細胞白血病(ALL)中的作用提供載體工具。
　　方法：
　　利用互聯(lián)網(wǎng)資源,設計并合成三對針對IK6基因可能有效的SiRNA,脂質(zhì)體瞬時轉染急性淋巴細胞白

2、血病細胞系Sup-B15,熒光顯微鏡、流式細胞術檢測轉染效率;采用RT-PCR、Western-Blot實驗技術從基因、蛋白水平檢測IK6的表達,篩選出對Sup-B15細胞系IK6基因沉默效率最高的一對SiRNA序列;然后經(jīng)化學合成OligoDNA,退火形成雙鏈DNA,與經(jīng)AgeI和EcoRI雙酶切后的GV112載體連接轉化得到pLV-shIK6慢病毒表達載體,用PCR法篩選陽性克隆并測序鑒定。將pLV-shIK6、pHelper1.0

3、和pHelper2.0三種質(zhì)粒共轉染人胚腎293T細胞,包裝產(chǎn)生重組慢病毒并濃縮,以孔稀釋法測定病毒滴度。慢病毒感染Sup-B15細胞后,熒光顯微鏡觀察慢病毒感染Sup-B15細胞的效率,RT-PCR及Western-Blot檢測IK6在感染慢病毒后Sup-B15細胞中的表達。
　　結果：
　　熒光顯微鏡下觀察到約80％左右的細胞帶紅色熒光;流式細胞術檢測SiRNA片段經(jīng)脂質(zhì)體瞬時轉染Sup-B15細胞的效率為80.41%;

4、與對照組相比,三對SiRNA瞬時轉染Sup-B15細胞IK6mRNA、蛋白表達均顯著抑制(P﹤0.001),其中SiRNA-2組沉默效率最高,且與時間呈正相關。PCR和測序證實,成功構建IK6-shRNA的慢病毒表達載體pLVshIK6。包裝慢病毒,濃縮病毒懸液的滴度為8×108TU/ML,滿足實驗需要。當感染倍數(shù)(MOI)為100時,Sup-B15細胞的感染率可達到80%。感染后的Sup-B15細胞Ik6在轉錄和蛋白水平表達明顯下調(diào)(