鮑曼不動桿菌耐藥性及其泛耐株分子流行病學(xué)、耐藥機制和治療策略研究.pdf

1、不動桿菌屬細菌是一類條件致病菌，廣泛分布于自然界、醫(yī)院環(huán)境和人體皮膚表面，如額頭、耳朵、喉嚨、腋下、手部、腹股溝、會陰、趾間都有不動桿菌。不動桿菌是引起醫(yī)院感染的重要病原菌，主要引起醫(yī)院獲得性肺炎，尤其在免疫受損、氣管切開、使用呼吸機病人中。在某些地方不動桿菌的感染甚至已超過了銅綠假單胞菌。近年來隨著抗菌藥物的不斷研究和應(yīng)用，不動桿菌屬細菌對常用抗菌藥物如β-內(nèi)酰胺類，甚至碳青霉烯類藥物的耐藥性不斷增加。目前大多數(shù)不動桿菌為多重耐藥(M

2、ulti-drugResistantAcinetobacter，MDR-A)即同時對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥。不動桿菌感染有爆發(fā)流行的趨勢。自從1991年在美國紐約第一次出現(xiàn)耐碳青霉烯的不動桿菌爆發(fā)流行以來，阿根廷、比利時、巴西、古巴、英國、法國、西班牙、新加坡、韓國、香港等地均有報道。我國此類研究不多，本文就沈陽地區(qū)鮑曼不動桿菌耐藥性進行分析，同時對耐碳青霉烯的鮑曼不動桿菌的分子流行病學(xué)、耐藥機制及體外聯(lián)合藥敏實驗進行研

3、究。 方法：標本來源于2001年1月～2003年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院所有住院及門診患者的細菌學(xué)送檢標本，同時收集中國醫(yī)科大學(xué)2003年3月至2004年5月附屬一院(12株)及二院(8株)臨床分離的亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌20株，具體來源于附屬一院ICU4株，呼吸病房5株，普外三病房1株，感染科病房1株，干診1株，附屬二院ICU8株，均為痰標本。細菌鑒定應(yīng)用法國生物梅里埃公司API鑒定系統(tǒng)，藥敏試驗采用K-B紙片擴散法。采用

4、E-test測定多種抗生素對亞胺培南耐藥的20株鮑曼不動桿菌的M1C值，低熔點膠灌膜，蛋白酶K消化24小時，ApaⅠ37℃酶切10小時CHEFMAPPERTM電泳儀(美國BIO-RAD產(chǎn)品)電泳22小時，電泳條件：14℃，120°，6V/CM，5-22S剃度電泳，進行同源性分析，應(yīng)用SPSS10.1統(tǒng)計學(xué)軟件繪制菌株間關(guān)系的樹狀圖。采用PhastSystem電泳儀測定等電點，三維試驗法檢測酶水解亞胺培南能力，采用Promegahighp

5、ureplasmidisolationkit質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。供體菌為臨床分離到的耐泰能鮑曼不動桿菌，受體菌為大腸桿菌C600，科瑪嘉平板為篩選平板，進行接合實驗。IMP、VIM、OXA型碳青霉烯酶及Ⅰ，Ⅱ類整合酶基因的PCR及序列分析擴增，PCR產(chǎn)物純化后送上海生工測序，結(jié)果在GenBank網(wǎng)上查詢。采用超聲物理法制備外膜蛋白，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測外膜蛋白。評價多粘菌素B與利福平聯(lián)合應(yīng)用，采用棋盤法設(shè)

6、計：將多粘菌素B和利福平以滅菌MH肉湯倍比稀釋成11個濃度，分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0μg/ml。將配好的不同濃度的兩種藥物兩兩組合加入96孔平板中，37℃過夜培養(yǎng)。觀察結(jié)果，記錄單獨應(yīng)用兩藥的最低抑菌濃度MIC甲藥單用和MIC乙藥單用，并選擇最佳組合效應(yīng)時各自的MIC甲藥聯(lián)用和MIC乙聯(lián)聯(lián)用，F(xiàn)IC指數(shù)計算與判讀：FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙

7、聯(lián)聯(lián)用/MIC乙藥單用。FIC指數(shù)≤0.5，協(xié)同作用；＞0.5～1，相加作用；＞1～2，無關(guān)作用；＞2,拮抗作用。 結(jié)果： 1、三年中鮑曼不動桿菌對所監(jiān)測抗生素的耐藥性有逐步升高的趨勢。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥率增加迅速，2001年為2.5％、2002年為5.6％，2003年迅速增為14.3％。ICU病房耐藥率尤其嚴重，特別是亞胺培南耐藥率高達35％。 2、20株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌均為泛耐藥菌株，對多

8、粘菌素B仍保持良好的敏感性(90％)，莫西沙星對約40％菌株的MIC在0.125μg/ml以下，對臨床選擇治療亞胺培南耐藥的鮑曼不動桿菌感染提供參考。PFGE示：20株菌株分為A(A1，A2，A3)，B(B1，B2)，C，D，E五個型，A1型9株，其中附屬二院ICU5株，附屬一院呼吸科3株，干診1株；A2型1株，A3型1株，均來自附屬一院呼吸科。這些菌株均出現(xiàn)于2004年4月-6月，其密集程度可以說是一次很大的暴發(fā)流行，并且兩個醫(yī)院間存

9、在交叉?zhèn)鞑?。B1型4株，3株來自附屬一院ICU科，一株來自普外3病房，均出現(xiàn)于2003年3月，說明存在醫(yī)院內(nèi)科室之間的傳播。B2型2株，來自附屬二院ICU，2003年8月菌株。C、D、E各一株，分別來自附屬一院感染科、一院ICU和附屬二院ICU。 3、20株均產(chǎn)生以下幾種酶：pI5.4可被克拉維酸抑制(TEM-1)，pI6.7不被克拉維酸和鄰氯西林抑制，pI＞9可被鄰氯西林抑制(AmpC酶)。三維試驗證實20株菌均產(chǎn)生能水解亞胺

10、培南的β內(nèi)酰胺酶，均不能被克拉維酸、氯唑西林、2-巰基丙酸抑制。未提出質(zhì)粒。接合實驗，科瑪嘉平板上無藍色菌落生長。采用1MP、V1M型、OXA-24特異引物擴增，20株菌均陰性；但用OXA-23特異引物擴增，20株菌均獲得約1067bp片段的PCR產(chǎn)物，此產(chǎn)物包括編碼OXA-23酶開放讀碼的全長序列，純化后測序并與Genebank中公布的序列比較后發(fā)現(xiàn)，20株菌的PCR產(chǎn)物100％與OXA-23同源。所有20株菌均含Ⅰ類整合酶基因，但無

11、Ⅱ類整合酶基因。外膜蛋白SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)有四個克隆存在31KD條帶處消失。 4、多粘菌素B與利福平聯(lián)用后，多粘菌素B對亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌的MIC50由2μg/ml降至0.25μg/ml。利福平的MIC50由16μg/ml降至2μg/ml。FIC指數(shù)在0～0.5、0.5～1的百分率分別為55％、45％。 結(jié)論：三年中鮑曼不動桿菌對所監(jiān)測抗生素的耐藥性有逐步升高的趨勢。碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌增多，但對多粘菌素B