HBV相關(guān)肝細(xì)胞肝癌組織中HBV cccDNA突變位點(diǎn)的篩選及功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus， HBV）突變與肝細(xì)胞肝癌（ hepatocellular carcinoma，HCC）的相關(guān)性一直是乙肝病毒致癌作用研究的熱點(diǎn)。然而，從感染 HBV到 HCC，往往經(jīng)歷“慢乙肝-肝硬化-HCC”這一漫長(zhǎng)過(guò)程，加之 HBV基因組易于變異和宿主的免疫選擇壓力，感染者體內(nèi)的 HBV往往存在與“野生序列”高度相關(guān)但不完全相同的變異株的動(dòng)態(tài)種群，即準(zhǔn)種。這一現(xiàn)象提示我們，每一個(gè)體內(nèi) HBV的突

2、變往往隨著感染時(shí)間和疾病進(jìn)程而逐漸增加。在既往研究中，通過(guò)比較 HBV感染不同時(shí)期的患者外周血中病毒的突變情況，發(fā)現(xiàn)了與 HCC相關(guān)的 HBV突變。但由于肝癌患者血清中的HBV突變來(lái)自于肝癌組織和非癌肝組織中的 cccDNA突變，并且癌組織中病毒復(fù)制能力相對(duì)較弱。因此，血清中病毒 DNA的突變不能有效地反映肝癌組織中HBV cccDNA的突變情況。HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，

3、cccDNA）只存在于感染的肝細(xì)胞核中，是 HBV復(fù)制的模板，具有一定的組織特異性。同時(shí)，為消除不同感染階段這一時(shí)間因素對(duì) HBV變異程度的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較 HCC患者配對(duì)的肝癌與癌旁組織中 HBV cccDNA突變位點(diǎn)的差異，分析這些病毒突變的臨床相關(guān)性，尋找與 HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的病毒突變位點(diǎn)，開(kāi)展與 HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的病毒突變位點(diǎn)相應(yīng)的功能研究，探索 HBV基因組突變的可能致癌機(jī)制。
　　本研究采用29例 HCC患

4、者術(shù)后的癌與癌旁組織，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)組織中 HBV cccDNA和 HBV total DNA水平，滾環(huán)擴(kuò)增及 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序 HBV cccDNA全基因組，與野生序列比對(duì)尋找 HBV cccDNA的突變位點(diǎn)，并分析 HBV cccDNA突變位點(diǎn)的臨床相關(guān)性。以 HBV1.2×質(zhì)粒為基礎(chǔ)，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建HBV1.2×-G588C突變及HBV1.2×-T1719G突變質(zhì)粒，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒突變位

5、點(diǎn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)3.5kb RNA和total RNA及上清中HBV DNA水平的影響，用時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)病毒突變位點(diǎn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中 HBsAg和 HBeAg含量的影響。采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè) T1719G突變后是否對(duì) HBV EnhII的活性有影響，并進(jìn)一步通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）-PCR技術(shù)檢測(cè) T1719G突變后對(duì) HNF3β與 EnhII之間結(jié)

6、合力的影響。通過(guò)分別與野生型 HBx質(zhì)粒及HBx-T1719G突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，檢測(cè)T1719G突變的HBx蛋白對(duì)HBV復(fù)制能力的影響。研究結(jié)果如下：
　?。?）完成了25個(gè)癌組織標(biāo)本和29個(gè)癌旁組織標(biāo)本中 HBV cccDNA的全基因組測(cè)序，其中有19對(duì)是配對(duì)的癌組織與癌旁組織。在19對(duì)HBV cccDNA序列中，18對(duì)是C基因型，1對(duì)是B基因型。25個(gè)癌組織的HBV cccDNA序列中23個(gè)是HBV C基因型。將所得到的18對(duì)

7、 C基因型的 cccDNA序列與 HBV的野生序列進(jìn)行比對(duì)，獲得HBV cccDNA全基因組的突變位點(diǎn)。以突變率大于10％的作為突變熱點(diǎn)，共篩選出突變熱點(diǎn)233個(gè)。完成了29對(duì)癌與癌旁組織HBV cccDNA和total DNA的定量檢測(cè)。
　　（2）將23個(gè)癌組織中的各突變位點(diǎn)與患者的臨床資料（術(shù)后生存時(shí)間，BCLC分級(jí)、術(shù)前 AFP濃度等）及 HBV DNA定量結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示 T1719G、C1329A和 T30

8、98C突變與患者的術(shù)后生存時(shí)間相關(guān)，攜帶突變型A1329或C3098的肝癌患者術(shù)后生存時(shí)間長(zhǎng)于攜帶野生型 C1329或T3098的患者，而 G1719突變組肝癌患者的術(shù)后生存時(shí)間短于 T1719野生型組；G1078T、C1653T、G1727A、C1913A、T1978C和 C3116T突變位點(diǎn)與患者術(shù)前高濃度的 AFP相關(guān)；T1719G和 C1913A兩個(gè)突變位點(diǎn)與HBV DNA定量結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，突變型G1719組HBV c

9、ccDNA和HBV total DNA含量均低于野生型T1719組，突變型A1913組HBV cccDNA的含量高于野生型 C1913組；我們還發(fā)現(xiàn)，突變位點(diǎn) T1719G與患者的 BCLC分級(jí)相關(guān)， T1719野生型組傾向于較低的 BCLC分級(jí)，G1719突變型組傾向于較高的 BCLC分級(jí)結(jié)果提示T1719G突變后患者的預(yù)后差；并且Cox多因素分析結(jié)果顯示T1719G突變是HCC患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立的危險(xiǎn)預(yù)后預(yù)測(cè)因素，而T3098C

10、突變是HCC患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立的保護(hù)預(yù)后因素。
　?。?）G588C突變（可引起 G145A氨基酸突變）只存在于3例癌組織（7C、569C、831C）中，提示 G588C突變可能與 HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。G588C突變型組上清中HBsAg的含量低于野生型組（p〈0.05），G588C突變型組細(xì)胞內(nèi)的 HBsAg的含量高于野生型組（p〈0.05），G588C突變型組HBsAg的總量和HBV1.2×野生型組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

11、p〉0.05），而 G588C突變型組上清中 HBsAg與細(xì)胞內(nèi) HBsAg的比值明顯低于HBV1.2×野生型組（p〈0.05），并且，G588C突變型組上清中HBV DNA水平與HBV1.2×野生型組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p〉0.05）。結(jié)果表明G588C突變不影響HBV的復(fù)制能力，也不影響HBsAg的表達(dá)，而可能影響了HBsAg從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外的分泌。
　　（4）在 Huh7和 HepG2肝癌細(xì)胞中，HBV1.2×-T171

12、9G突變型質(zhì)粒與 HBV1.2×野生型質(zhì)粒相比，可以明顯降低培養(yǎng)上清中 HBsAg和 HBeAg的含量（p〈0.001）、細(xì)胞內(nèi) HBV total RNA和3.5kb RNA水平（p〈0.001）、細(xì)胞培養(yǎng)上清中 HBV DNA水平（p〈0.001），雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在 Huh7、HepG2、SK-Hep1和 HEK293T四種肝癌細(xì)胞中，T1719G突變組的 EnhII的活性低于野生型組（p〈0.001），當(dāng)野生型質(zhì)粒和T1

13、719G突變型質(zhì)粒分別與HNF3β質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，T1719G突變組的EnhII的活性也低于野生型組（ p〈0.001），提示 T1719G突變既降低了 EnhII活性，又影響了HNF3β對(duì)EnhII的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明T1719G突變影響了HNF3β和 HBV EnhII之間的結(jié)合力，突變型 G1719與 HNF3β之間的結(jié)合力弱于 T1719與HNF3β之間的結(jié)合力。在 Huh7和 HepG2細(xì)胞中，當(dāng)

14、HBV1.2×和 HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與 HBx質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時(shí)，與未共轉(zhuǎn)染組相比上清中 HBsAg和 HBeAg的水平?jīng)]有明顯變化（p〉0.05）；但當(dāng)HBV1.2×和HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時(shí)，與未共轉(zhuǎn)染組相比，上清中 HBsAg和 HBeAg的水平仍然明顯下降（ p〈0.001）；并且， HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與 HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中的HBsAg和HBeAg的水平

15、低于HBV1.2×質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組（p〈0.001）；而HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中的HBsAg和HBeAg的水平與HBV1.2×質(zhì)粒與 HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p〉0.05）；當(dāng) HBV1.2×和HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx質(zhì)粒或HBx-mut突變質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時(shí)，與未共轉(zhuǎn)染組相比上清中HBV DNA的水平都升高（p〈0.001）；但HBV1.2×-T1719G

16、質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中HBV DNA的水平低于HBV1.2×質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p〈0.001）；而 HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與 HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中HBV DNA的水平與HBV1.2×質(zhì)粒與HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p〉0.05）。這些結(jié)果表明T1719G突變可以降低HBV的復(fù)制能力，其中突變的HBV EnhII和突變的HBx蛋白都起到了重要的作用。