柞蠶熱激蛋白90基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、柞蠶是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的野生絹絲昆蟲，屬于鱗翅目、大蠶蛾科、柞蠶屬。柞蠶繭可作為紡織工業(yè)原料使用，其幼蟲和蛹還具有重要的藥用和食用價(jià)值。盡管昆蟲在高溫和低溫等不利環(huán)境下的生活史對(duì)策已有較多研究報(bào)道，但柞蠶對(duì)于高溫耐受性的生化與分子機(jī)制仍未被解析。熱激蛋白(heatshockproteinHsp)是一種抗逆蛋白，在細(xì)胞受到脅迫時(shí)表達(dá)量會(huì)增加，對(duì)細(xì)胞起到一種保護(hù)作用，幫助生物機(jī)體度過不利環(huán)境條件。近期的研究還表明，HSPs還與生物的生長(zhǎng)

2、、發(fā)育與分化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和育性轉(zhuǎn)化有關(guān)。本論文在克隆獲得柞蠶熱激蛋白90(Hsp90)基因序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)蛹在不同溫度脅迫下的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定，并且大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行了成功的表達(dá)，從而為闡明柞蠶耐高溫的分子機(jī)制提供參考。主要結(jié)果如下：
　　 1.柞蠶Hsp90克隆及序列分析：
　　 根據(jù)GenBank中昆蟲熱激蛋白基因序列同源性設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增(RA

3、CE)技術(shù)成功克隆了柞蠶Hsp90基因cDNA全長(zhǎng)序列。柞蠶Hsp90基因cDNA全長(zhǎng)序列序列全長(zhǎng)2482bp，開放閱讀框長(zhǎng)2154bp，編碼717個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的該蛋白的相對(duì)分子量和等電點(diǎn)分別為82.6kDa和5.0。該序列具有Hsp90家族的典型特征和特殊的功能結(jié)構(gòu)域，并且與多種生物的Hsp90核苷酸序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列都具有較高的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，柞蠶Hsp90和天蠶的Hsp90氨基酸同源性最高，為94.5％。

4、　　 2.高溫脅迫下柞蠶體內(nèi)Hsp90基因表達(dá)量的變化
　　 提取柞蠶幼蟲及蛹期的不同組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA進(jìn)行半定量RT-PCR。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hsp90在精巢中的表達(dá)量較高，而其他被檢組織中的表達(dá)量無明顯差異。
　　 利用18SrRNA作為內(nèi)參基因，以柞蠶不同組織的RNA為模板，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SBGYReal-timePCR)技術(shù)分別檢測(cè)了25℃和42℃脅迫處理30min后柞蠶蛹期體內(nèi)Hsp

5、90基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，Hsp90基因表達(dá)量隨著溫度升高呈增加的趨勢(shì)。42℃脅迫下，不同組織內(nèi)的Hsp90基因表達(dá)量均高于對(duì)照的(P<0.05)。Hsp90基因較高的表達(dá)水平說明這種蛋白在柞蠶抗高溫中起到一定的保護(hù)作用。
　　 3.Hsp90基因的原核表達(dá)
　　 PCR法擴(kuò)增了柞蠶熱激蛋白90的ORF，并連接至pET-28a(+)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，用不同濃度的IPTG進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)