Nutlin-1協(xié)同全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 全反式維甲酸(ATRA)是臨床用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的最重要的藥物之一。但維甲酸耐藥使其療效降低,阻礙其臨床的廣泛應(yīng)用。Nutlin-1為p53與其E3酶MDM2結(jié)合的抑制劑。本課題將探討Nutlin-1與ATRA兩藥合用是否能夠協(xié)同誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的分化,初步研究其作用機(jī)制,并探索Nutlin-1的靶點(diǎn)MDM2在細(xì)胞分化過程中發(fā)揮的功能,希望為克服維甲酸耐藥提供新思路。
　　 方法:
　　 選用三株白

2、血病細(xì)胞株HL60(p53缺失型)、NB4(p53突變型)、U937(p53野生型),探討Nutlin-1協(xié)同ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化的分子機(jī)制。(1)運(yùn)用MTT法測(cè)定Nutlin-1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,以及高濃度ATRA的細(xì)胞毒作用。(2)細(xì)胞經(jīng)PI單染后,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析Nutlin-1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。(3)采用CD11b表面抗原的檢測(cè)以及NBT還原實(shí)驗(yàn)觀察ATRA單用或Nutlin-1與ATRA合用對(duì)細(xì)胞分化水平的影響。(4)

3、運(yùn)用小干擾RNA技術(shù)(siRNA技術(shù))將U937細(xì)胞內(nèi)p53沉默。(5)使用RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)MDRI、c-myc、CEBP/β的mRNA水平和p-gP、RARα的蛋白水平。(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)染料JC1和Rhodamine123的外排作用。(7)通過ATP酶活性的測(cè)定以及分子docking模型觀察Nutlin-1作為底物與p-gP的結(jié)合作用。
　　 以實(shí)體瘤細(xì)胞(骨肉瘤細(xì)胞U2OS和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞

4、CHP126)作為研究對(duì)象,探討MDM2在ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程中的作用。(1)通過細(xì)胞形態(tài)變化,細(xì)胞突觸生長(zhǎng)情況以及各分化分子標(biāo)記物的表達(dá)水平檢測(cè)CHP126細(xì)胞的分化情況:鏡下觀察并記錄細(xì)胞的形態(tài)變化;運(yùn)用ImagePro5.0軟件分析并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞突觸的生長(zhǎng)情況;WesternBlot檢測(cè)分子標(biāo)記物MAP2和β3-tubulin表達(dá)水平的變化。(2)通過細(xì)胞增殖情況以及各分化分子標(biāo)記物的表達(dá)水平檢測(cè)U2OS細(xì)胞的分化情況:采用細(xì)胞計(jì)

5、數(shù)法檢測(cè)其增殖情況;RT-PCR和WesternBlot分別測(cè)定分子標(biāo)記物ALP、RUNX2、OPN的mRNA和蛋白表達(dá)水平。(3)分別運(yùn)用siRNA和小發(fā)卡RNA技術(shù)(shRNA技術(shù))對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDM2和p53的蛋白表達(dá)進(jìn)行沉默。(4)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,并建立穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒PCMV-myc3-MDM2的CHP126和U2OS細(xì)胞株。(5)運(yùn)用RT-PCR以及WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDM2的mRNA以及蛋白水平。
　　

6、結(jié)果:
　　 MTT結(jié)果顯示,相同濃度的Nutlin-1只有對(duì)p53野生型的U937細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用,對(duì)HL60、NB4和p53沉默的U937細(xì)胞株均無細(xì)胞毒作用。并且Nutlin-1(20μM)能夠誘導(dǎo)U937細(xì)胞產(chǎn)生33.63％的凋亡率,而作用于其他細(xì)胞則無明顯的凋亡現(xiàn)象。CD11b表面抗原的檢測(cè)結(jié)果顯示,在HL60細(xì)胞中,ATRA單用誘導(dǎo)細(xì)胞分化率為15.57%,而5μM、10μM、20μMNutlin-1與之合用后,細(xì)

7、胞分化率分別達(dá)到19.04%、21.83%、30.16%,呈現(xiàn)濃度依賴性。同樣在NB4細(xì)胞中,Nutlin-1的這一作用更加明顯。但在U937細(xì)胞中則觀察不到Nutlin-1協(xié)同ATRA促分化的現(xiàn)象。NBT還原實(shí)驗(yàn)也說明了同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。ATRA單用誘導(dǎo)HL60、NB4、U937細(xì)胞中NBT還原率分別為12.68%、46.20%、31.00%,Nutlin-1合用后NBT還原率則變?yōu)?0.08%、83.06%、31.94%。同時(shí)我們將U

8、937細(xì)胞中的p53沉默,Nutlin-1與ATRA依然沒有合用效果。在ATRA處理HL60和NB4細(xì)胞過程中,p-gp的蛋白水平顯著增高。并且MDR1的mRNA表達(dá)水平也呈現(xiàn)相同的上調(diào)趨勢(shì).然而這些變化在U937細(xì)胞中均不存在。之后我們用ATRA預(yù)處理HL60細(xì)胞1到3天,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)染料JC1和Rhodaminel23的外排作用均逐漸增強(qiáng)。同時(shí)我們檢測(cè)了高濃度ATRA(0-50μM)對(duì)NB4細(xì)胞的毒性作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),已經(jīng)使用0.01μ

9、MATRA預(yù)處理3天的NB4細(xì)胞對(duì)ATRA的敏感性明顯下降,但是當(dāng)用經(jīng)典的p-gp底物維拉帕米與ATRA合用時(shí),高濃度ATRA的毒性作用則被部分逆轉(zhuǎn).在p-gPATP酶活性實(shí)驗(yàn)中,Nutlin-1對(duì)酶活性的激活作用呈現(xiàn)濃度依賴性,而ATRA也顯示為p-gP的底物。在此基礎(chǔ)上,分子docking模型提示p-gp蛋白的特定氨基酸殘基能夠與Nutlin-1的兩個(gè)異構(gòu)體1a和1b結(jié)合。RT-PCR和WesternBlot的結(jié)果分別顯示,Nutl

10、in-1與ATRA合用后能夠明顯抑制c-myc基因的表達(dá),并顯著增強(qiáng)C/EBPβ基因的激活,ATRA能夠誘導(dǎo)其受體RARα蛋白的降解,而Nutlin-1合用后能夠促使RARα蛋白水平下調(diào)的更加明顯。
　　 在ATRA處理CHP126和U2OS細(xì)胞1到3天過程中,MDM2蛋白水平明顯下調(diào),但是其mRNA水平保持不變。將MDM2沉默之后,ATRA作用5天能夠顯著誘導(dǎo)CHP126細(xì)胞突觸增多增長(zhǎng),MAP2蛋白表達(dá)水平明顯增高;在U2O

11、S細(xì)胞中,抑制MDM2的表達(dá)同樣使其分化標(biāo)記物ALP、RUNX2、OPN的表達(dá)上調(diào),并且ATRA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用更加顯著。在MDM2穩(wěn)定高表達(dá)的CHP126和U2OS細(xì)胞株中,結(jié)果則相反,即ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程被抑制。將U2OS細(xì)胞中p53沉默后,再將MDM2沉默,發(fā)現(xiàn)ATRA依然能夠誘導(dǎo)分化標(biāo)記物RUNX2和OPN蛋白水平的上調(diào),說明MDM2對(duì)分化發(fā)揮的負(fù)性調(diào)控作用為p53非依賴性的。
　　 結(jié)論:
　　 Nu

12、tlin-1與ATRA有協(xié)同誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的作用,與p53的功能狀態(tài)無關(guān)。同時(shí)我們證明了Nutlin-1為p-gp的底物能夠競(jìng)爭(zhēng)性與其結(jié)合,從而抑制細(xì)胞對(duì)ATRA的外排,增強(qiáng)其下游通路的激活。作為Nutlin-1的靶點(diǎn),MDM2在ATRA誘導(dǎo)CHP126和U2OS細(xì)胞分化過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用,并且MDM2這一功能為p53非依賴性的。本課題證實(shí)了Nutlin-1確實(shí)能夠增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化的能力,并初步探索其機(jī)制,為Nutlin