急性早幼粒白血病細(xì)胞中全反式維甲酸對UBA3表達(dá)的調(diào)控作用與機(jī)制.pdf

1、背景：急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）是一種較為罕見的疾病，是急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的一種特殊類型。它是目前人們認(rèn)識最清楚的惡性腫瘤之一，同時也是唯一一個能夠通過靶向療法治愈的惡性腫瘤。20世紀(jì)70年代，蒽環(huán)類藥物的療法讓一些APL病人得到治愈，但易導(dǎo)致DNA損傷。直到1985年全反式維甲酸（all-trans retinoic ac

2、id，ATRA）的引入提升了這些病人的治療反應(yīng)，并使這種疾病的預(yù)后獲得了革命性的進(jìn)步。臨床試驗中，結(jié)合ATRA的現(xiàn)代治療方法使得超過90％的病人脫離治療并無病生存五年以上。ATRA在體內(nèi)和體外均可誘導(dǎo)APL細(xì)胞迅速分化為粒細(xì)胞，并且臨床上ATRA只需三到五周就能使APL病人緩解。ATRA發(fā)揮治療作用的機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)，至今尚未完全闡明。NEDD8（neural precursor cell expressed development

3、ally downregulated protein8）是近年來研究比較熱的多種類泛素蛋白中的一種，是一個僅包含81個氨基酸的小分子蛋白質(zhì)，其與相應(yīng)底物共價結(jié)合的過程稱為 Neddylation。β淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合蛋白1（ amyloid-βprecursor protein binding protein1，APPBP1）與類泛素修飾活化酶3（ubiquitin-like modifier activating enzyme3，

4、UBA3）結(jié)合而成的異二聚體構(gòu)成Neddylation的活化酶E1，而UBA3在其中作為催化亞基，對Neddylation修飾的正常進(jìn)行至關(guān)重要。經(jīng)典的NEDD8底物是cullins，主要參與細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控；介導(dǎo)cullins發(fā)生Neddylation的E3連接酶是Rbx1（RING box protein1），生成的Neddylated cullins（約90-100kDa）增強(qiáng)相應(yīng)酶復(fù)合體的活性。已有研究證明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展很

5、可能與Neddylation修飾系統(tǒng)的異常有關(guān)。NEDD8活化酶E1的特異性抑制因子MLN4924已經(jīng)在多種實體瘤和白血病中顯示具有很好的治療效果，進(jìn)入臨床II期研究。因此，靶向Neddylation修飾系統(tǒng)有望為未來癌癥治療帶來新的曙光。已有研究表明，Neddylation促進(jìn)AML細(xì)胞的生存和增殖，但是還不清楚Neddylation對APL細(xì)胞的分化有無影響，及在ATRA的治療效應(yīng)中具有怎樣的作用。為解答上述科學(xué)問題，我們開展了本課

6、題研究。
　　目的：在APL細(xì)胞中探索Neddylation參與ATRA治療作用的機(jī)制；探討ATRA對UBA3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制；探索UBA3在APL細(xì)胞惡性生長中的作用及分子機(jī)制；探索APL治療的新靶點(diǎn)。
　　方法：為了研究ATRA對UBA3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以ATRA處理APL細(xì)胞系HL60及NB4細(xì)胞，通過Western Blot（WB）檢測Neddylation相關(guān)蛋白水平指標(biāo)Neddylated cullins

7、、UBA3及APPBP1的表達(dá)，通過實時熒光定量PCR（QPCR）檢測UBA3的mRNA表達(dá)水平。為了研究ATRA調(diào)節(jié)UBA3表達(dá)的分子機(jī)制，用蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑E64d/pepstatinA處理NB4及HL60細(xì)胞，WB檢測UBA3及Neddylated cullins的水平；用ATRA處理HL60及NB4細(xì)胞后，WB檢測自噬指標(biāo)LC3BII的表達(dá)情況；用自噬誘導(dǎo)劑rapamycin處理HL60及NB4細(xì)胞后，WB

8、檢測LC3BII、UBA3及Neddylated cullins的表達(dá)情況。為研究Neddylation系統(tǒng)在APL細(xì)胞惡性生長中的作用及其可能機(jī)制，通過NEDD8活化酶E1抑制劑MLN4924處理或者以短發(fā)夾RNA（short hairpinRNA， shRNA）敲低 UBA3抑制 Neddylation，進(jìn)行細(xì)胞生長曲線分析和軟瓊脂集落形成實驗分析檢測對惡性生長的影響；凋亡檢測和細(xì)胞周期分析探討影響惡性生長的機(jī)制；流式細(xì)胞儀檢測表面

9、Marker CD11b和吉姆薩染色揭示對APL細(xì)胞未分化狀態(tài)的影響。為分析經(jīng)典底物在其中的作用，我們用攜帶Rbx1 shRNA的慢病毒感染HL60細(xì)胞，引起內(nèi)源性Rbx1的表達(dá)沉默進(jìn)而導(dǎo)致cullins Neddylation的減弱，并通過上述方法觀察其對HL60細(xì)胞生長曲線、凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程、形態(tài)及CD11b表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：⑴WB檢測ATRA處理APL細(xì)胞株HL60及NB4細(xì)胞0d、1d、2d、3d、4d、5d后的U

10、BA3的表達(dá)結(jié)果顯示：隨著作用時間的延長，UBA3的表達(dá)量逐漸降低，表明ATRA能夠抑制APL細(xì)胞中UBA3的表達(dá)，并且呈時間依賴性。QPCR檢測ATRA處理HL60細(xì)胞0d、2d、3d、4d、5d后的UBA3的表達(dá)結(jié)果顯示：隨著時間的延長，UBA3的mRNA水平卻呈上升趨勢，因此在ATRA處理APL細(xì)胞時，UBA3的蛋白水平與其mRNA水平的變化是相反的，提示UBA3表達(dá)量的下降可能是蛋白穩(wěn)定性下降。⑵蛋白酶體抑制劑MG132處理HL

11、60細(xì)胞不能逆轉(zhuǎn)ATRA誘導(dǎo)的UBA3表達(dá)量下降，提示UBA3的下降不是通過蛋白酶體介導(dǎo)的。溶酶體抑制劑E64d/pepstatinA在HL60細(xì)胞里比較好的逆轉(zhuǎn)ATRA誘導(dǎo)的UBA3蛋白量下降，而且在NB4細(xì)胞中也有部分的逆轉(zhuǎn)，提示ATRA是通過溶酶體途徑誘導(dǎo)UBA3蛋白量下降的。ATRA處理HL60及NB4細(xì)胞后，自噬指標(biāo)LC3BII上升，證實了ATRA能夠誘導(dǎo)自噬；而自噬誘導(dǎo)劑rapamycin處理HL60及NB4細(xì)胞后，UBA3

12、及Neddylated cullins指標(biāo)均下降，提示ATRA通過誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)溶酶體活性進(jìn)而減弱UBA3蛋白的表達(dá)量。⑶通過MLN4924處理或者敲低UBA3抑制Neddylation，進(jìn)行如下分析：生長曲線分析表明，MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠顯著抑制HL60及NB4細(xì)胞的生長；軟瓊脂集落形成實驗分析表明MLN4924能夠顯著抑制HL60及NB4細(xì)胞的集落形成能力。?凋亡檢測和細(xì)胞周期分析表明MLN4924處理或者敲低UB

13、A3均能夠顯著促進(jìn)HL60及NB4細(xì)胞的凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯。吉姆薩染色結(jié)果表明MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠使HL60及NB4細(xì)胞胞漿染色變淺、漿核比增加及胞漿空泡增多；表面Marker CD11b檢測結(jié)果分析表明MLN4924處理或者敲低UBA3均能夠誘導(dǎo) HL60及NB4細(xì)胞CD11b表達(dá)增加。因此，UBA3及其介導(dǎo)的Neddylation促進(jìn)APL細(xì)胞生長、存活及細(xì)胞周期進(jìn)程，并維持其未分化狀態(tài)。⑷敲低Rbx1后

14、，生長曲線分析表明HL60細(xì)胞的生長受到顯著抑制；凋亡檢測表明HL60細(xì)胞的凋亡增加；細(xì)胞周期進(jìn)程分析表明HL60細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯在G0/G1期；吉姆薩染色結(jié)果表明HL60細(xì)胞胞漿染色變淺、漿核比增加及胞漿空泡增多；CD11b表面Marker檢測結(jié)果分析表明HL60細(xì)胞CD11b表達(dá)顯著增加。因此，敲低Rbx1以減弱cullins Neddylation具有和抑制整體Neddylation類似的效應(yīng)，提示Neddylation通過經(jīng)典底

15、物cullins促進(jìn)APL細(xì)胞的惡性生長。
　　結(jié)論：ATRA通過誘導(dǎo)自噬抑制UBA3的表達(dá)，進(jìn)而抑制Neddylation。UBA3及其介導(dǎo)的Neddylation促進(jìn) APL細(xì)胞生長、存活及細(xì)胞周期進(jìn)程，并維持其未分化狀態(tài)。對Neddylation的抑制作用是ATRA具有顯著治療效應(yīng)的重要機(jī)制。敲低Rbx1以減弱cullinsNeddylation具有和抑制UBA3類似的效應(yīng)，提示Neddylation通過經(jīng)典底物cullin