HER2抑制劑TAK165協(xié)同全反式維甲酸誘導人急性髓系白血病細胞分化的藥效及其機制研究.pdf

1、研究目的:
　　急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia，AML)是一種血液系統(tǒng)腫瘤，嚴重威脅人類生命健康。AML的重要標志是存在嚴重的髓系分化障礙。所以，目前認為可以將誘導分化治療作為臨床治療AML的一種有效的治療策略。全反式維甲酸（All-transretinoic acid，ATRA）是第一個成功用于臨床治療急性早幼粒細胞白血?。ˋcute promyelocytic leukemia，APL，A

2、ML型M3）的分化誘導劑。然而，APL患者在大量使用ATRA時會出現(xiàn)金反式維甲酸耐藥、復發(fā)等現(xiàn)象，同時還會產(chǎn)生不同程度的不良反應。此外，ATRA除了對APL患者有較好的療效，對于AML的其他亞型，都沒有顯著的治療效果。因此，尋找更為高效低毒的誘導分化藥物或采用藥物聯(lián)合方案完善維甲酸誘導分化治療策略是解決上述問題的關(guān)鍵途徑。
　　人表皮生長因子受體2(HER2)是ErbB家族中的重要成員，參與細胞生長，增殖，粘附和分化等重要生命過程

3、的調(diào)控。有文獻報道，抑制HER2的信號通路對白血病可能有潛在的治療作用。TAK165(Mubritinib)是一種HER2的特異抑制劑，其應用于腫瘤的治療目前仍處于臨床研究階段。有文獻報道，TAK165可以通過介導細胞凋亡，進而針對包括AML在內(nèi)的多種腫瘤細胞發(fā)揮抗腫瘤作用。但是，關(guān)于TAK165調(diào)控ATRA介導的AML細胞分化目前尚沒有文獻報道。因此，本課題擬通過實驗研究HER2抑制劑TAK165(Mubritinib)與ATRA聯(lián)合

4、應用，誘導AML細胞的分化效應，并進一步探討其內(nèi)在的分子機制。
　　研究方法:
　　選用人白血病細胞株HL60和NB4為主要研究對象，考察TAK165對于AML細胞的增殖以及周期分布的影響，并檢測TAK165與ATRA合用對于AML細胞的誘導分化作用。采用臺盼藍拒染法結(jié)合血細胞計數(shù)板計數(shù)檢測細胞增殖情況，描繪細胞生長曲線和存活率曲線;細胞經(jīng)碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測了細胞周期分布

5、的變化情況;應用Western blot檢測細胞周期相關(guān)蛋白和分化相關(guān)蛋白(c-Myc、p21、p27、C/EBPβ、PU.1)的表達;細胞經(jīng)CD11b-PE抗體孵育后通過流式細胞術(shù)檢測細胞表面分化抗原CD11b的表達;應用硝基四氮唑藍(NBT)還原法檢測細胞分化能力;應用瑞氏-吉姆薩染色法檢測細胞形態(tài)學變化;應用Real-time PCR檢測細胞內(nèi)分化相關(guān)因子(PU.1，C/EBPB、C/EBPE)的mRNA表達水平;
　　選用

6、人白血病細胞株HL60和NB4為主要研究對象，考察TAK165和ATRA誘導AML細胞分化的分子機制。細胞經(jīng)CD11b-PE抗體孵育后通過流式細胞術(shù)檢測細胞表面分化抗原CD11b的表達;應用硝基四氮唑藍(NBT)還原法檢測細胞分化能力;應用Real-time PCR檢測細胞內(nèi)RARB、PXN的mRNA表達水平;應用Western blot檢測HER2，RARα蛋白表達水平，檢測分化啟動因子STAT1表達及活化水平（STAT1、p-STA

7、T1 S727），MAPK家族蛋白表達以及活化水平(MEK、p-MEK、ERK、 p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK);利用HER2單克隆抗體藥物赫賽汀研究HER2靶點在TAK165與ATRA協(xié)同誘導AML細胞分化中的作用。用攜帶pCCL-RARα的慢病毒載體轉(zhuǎn)染HL60R細胞，通過過表達RARα檢測其在TAK165與ATRA協(xié)同誘導AML細胞分化過程中的作用。用攜帶shRNA-STAT1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染NB4細胞，通過

8、沉默STAT1檢測其在TAK165與ATRA協(xié)同誘導AML細胞分化過程中的作用。選用MEK/ERK特異性抑制劑PD98059和U0126、p38特異抑制劑SB203580和JNK特異性抑制劑SP600125，研究MAPK信號通路在TAK165與ATRA協(xié)同誘導AML細胞分化過程中的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1) TAK165引起AML細胞增殖抑制、周期阻滯，而不會引起明顯的細胞死亡。
　　TAK165作用于HL60和

9、NB4細胞，通過臺盼藍拒染法結(jié)合血細胞計數(shù)板計數(shù)，結(jié)果顯示TAK165會引起細胞增殖抑制，而且抑制程度呈劑量依賴性和濃度依賴性，但是不會引起明顯的細胞死亡。通過PI單染結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布的變化，結(jié)果顯示TAK165能夠使HL60和NB4細胞周期阻滯于G0/G1期。Westem blot檢測周期相關(guān)蛋白(c-Myc、p21、p27)的表達變化，顯示TAK165作用于HL60和NB4細胞，c-Myc蛋白表達下調(diào)，p21、p27表

10、達上調(diào)，確證了TAK165可以使HL60和NB4細胞發(fā)生周期阻滯。
　　2) TAK165協(xié)同ATRA誘導AML細胞分化。
　　TAK165與ATRA聯(lián)合作用于HL60和NB4細胞，通過血細胞計數(shù)板計數(shù)法，計數(shù)并描繪細胞生長曲線，結(jié)果表明TAK165可以明顯促進ATRA引起的HL60和NB4細胞的增殖抑制作用。通過PI染色法檢測細胞周期分布變化，TAK165可以協(xié)同ATRA使HL60和NB4細胞周期阻滯于G0/G1期。我們從

11、分子標志、生化功能、形態(tài)學和細胞分化相關(guān)基因和蛋白的表達情況幾方面確證了TAK165可以增強ATRA引起HL60和NB4細胞分化的作用。ATRA單獨作用于HL60和NB4細胞72小時，CD11b陽性率分別為24.8％±3.0％，而TAK165與ATRA聯(lián)合應用時，CD11b陽性率達到80.0％±3.4％。TAK165與ATRA聯(lián)合作用時，NBT還原能力也較TAK165和ATRA單獨作用時明顯增強，NBT陽性細胞比例由21.30％±2.4

12、5％到93.40％±1.19％。瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果顯示，TAK165與ATRA作用于HL60和NB4細胞，引起細胞胞體變小，細胞核固縮，核質(zhì)比例下降，而且TAK165與ATRA合用引起的細胞形態(tài)學變化與單用組相比更為明顯。此外，通過Realtime-PCR和Western blot檢測細胞分化相關(guān)基因(CEBPB、CEBPE、PU.1)，分化相關(guān)蛋白（C/EBPβ、PU.1）的表達情況，發(fā)現(xiàn)TAK165與ATRA聯(lián)合作用使分化相關(guān)基因

13、上調(diào)，相關(guān)蛋白的表達增加，確證了TAK165可以協(xié)同ATRA誘導AML細胞分化。
　　3) TAK165協(xié)同ATRA誘導AML細胞分化的機制研究。
　　通過Western blot檢測HL60和NB4細胞中HER2蛋白表達，結(jié)果顯示與HER2高表達的乳腺癌BT474相比，在AML細胞中幾乎檢測不到HER2蛋白的表達。加入HER2單克隆抗體藥物赫賽汀后，PI染色檢測周期分布結(jié)果顯示，赫賽汀既不能協(xié)同ATRA引起細胞周期阻滯，也

14、不會對TAK165和ATRA引起的G0/G1周期阻滯有明顯的促進作用。與之相對應的，加入赫賽汀后，CD11b陽性細胞比率也沒有明顯變化。以上結(jié)果說明，TAK165并不是通過抑制HER2來促進ATRA誘導AML細胞分化。
　　RT-PCR檢測細胞內(nèi)RARα靶基因表達的結(jié)果顯示，與TAK165和ATRA協(xié)同誘導分化效應一致，在HL60和NB4細胞中，RARB和PXN在TAK165與ATRA聯(lián)合作用時均發(fā)生明顯協(xié)同上調(diào)。而在RARα突變

15、的HL60R細胞中，給藥后RARB和PXN的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化。同時，TAK165與ATRA也不會引起HL60R細胞分化，CD11b陽性率由3.05±0.35％到10.98±0.10％。當在HL60R細胞中過表達RARα后，與對照組相比，細胞內(nèi)RARB和PXN基因水平發(fā)生了明顯上調(diào)，同時CD11b陽性率也從35.33±0.25％增強至67.02±4.94％。以上結(jié)果說明，RARα的激活參與了TAK165協(xié)同ATRA誘導AML細胞分化的

16、過程。
　　Western blot結(jié)果顯示，TAK165與ATRA作用于NB4細胞，協(xié)同上調(diào)了STAT1蛋白S727位點磷酸化水平。慢病毒介導的shRNA-STAT1顯著下調(diào)了NB4細胞中STAT1蛋白的表達水平。通過NBT還原實驗以及CD11b的檢測，結(jié)果顯示STAT1的敲除使TAK165對ATRA誘導細胞分化的協(xié)同作用發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果顯示，STAT1的激活在TAK165與ATRA協(xié)同誘導分化的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

17、>　　Western blot檢測結(jié)果表明，TAK165與ATRA聯(lián)合作用于HL60和NB4細胞時，可以激活MEK/ERK信號通路，p-MEK、p-ERK蛋白水平均會協(xié)同上調(diào)，而其相應原型蛋白水平不變。然而JNK和p38信號通路在這一過程中不會被激活，蛋白水平以及磷酸化水平均不變。JNK特異性抑制劑sp600125和p38特異性抑制劑SB203580對于TAK165和ATRA協(xié)同誘導分化效應影響不大。但是加入MEK特異性抑制劑PD980

18、59，U0126后，TAK165與ATRA合用組細胞分化水平有明顯的下降，CD11b陽性率從82.37％±0.37％到56.22％±0.68％，36.5％±2.88％。此外，Western bolt結(jié)果顯示，PD98059和U0126作用與NB4細胞后，會明顯抑制TAK165和ATRA合用引起的STAT1蛋白發(fā)生磷酸化激活。以上結(jié)果說明，MEK/ERK信號通路通過調(diào)控了STAT1的活性，進而影響了TAK165和ATRA協(xié)同誘導分化過程。