重組腺相關(guān)Ⅱ型病毒介導(dǎo)人TIMP1基因抑制肝癌侵襲和生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：全球每年死于肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的病人超過100萬人。在我國(guó)，肝癌已成為惡性腫瘤的第二大病因，每年死于HCC的病人數(shù)列全球第一位，對(duì)人類健康威脅極大。目前雖已有許多辦法和措施用于HCC的治療，包括：手術(shù)切除、放療、化療、介入治療、免疫治療、中藥治療和肝移植等，但獲得根治的僅為10％左右。影響HCC療效的最重要原因是肝癌轉(zhuǎn)移。 在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的進(jìn)程中，完善的 ECM(ext

2、racellular matrix， ECM)和BM (basement membrane，BM)是一個(gè)重要的屏障，可以限制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，在組織學(xué)上，BM完整性的破壞被認(rèn)為是惡性腫瘤侵襲開始的一個(gè)標(biāo)志。有許多酶類參與降解 ECM 和 BM 中成分。腫瘤細(xì)胞或腫瘤間質(zhì)組織能產(chǎn)生降解ECM和BM的蛋白水解酶系列，其中，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。金屬蛋

3、白酶組織抑制因子(tissue inhibi’tor of metalloproteinase， TIMPs)亦可為腫瘤細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)組織或正常組織產(chǎn)生。但卻具有拮抗MMP的功效。目前已有提取的天然MMPs抑制劑(MMPI)和人工合成的MMPIs用于抗癌研究。但除從鯊魚軟骨中提取的Neovastat(癌立消)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)外，其它尚皆在實(shí)驗(yàn)室研究階段。以分子生物學(xué)方法促進(jìn)TIMPs表達(dá)而抑制MMPs表達(dá)，重建MMPs-TIMPs平衡，

4、達(dá)到抑制肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移已成為目前TIMP研究的-大亮點(diǎn)?；蛑委煹睦硐虢Y(jié)果與載體系統(tǒng)的選擇具有非常密切的關(guān)系，載體需兼具精確、低毒、高表達(dá)、大容量等特點(diǎn)，常用的病毒載體包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒、單純皰疹病毒等。其中，腺相關(guān)病毒是目前公認(rèn)的較理想載體。rAAV2是近年來出現(xiàn)的新型基因治療載體，具有長(zhǎng)時(shí)間有效表達(dá)外源性基因、轉(zhuǎn)染后對(duì)機(jī)體無免疫反應(yīng)以及對(duì)治療者無致病性和基因定點(diǎn)整合等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，已成為基因治療研究的熱點(diǎn)。

5、 因此，本研究選擇腺相關(guān)病毒rhhV2為載體，重組攜帶全長(zhǎng)TIMP1基因 cDNA的rhAV2-TIMP1，以探討其可能的抗癌效能及機(jī)制。 研究目標(biāo)： 1.構(gòu)建高滴度的攜帶人全長(zhǎng)TIMP1基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV2-TIMP1，為進(jìn)一步探討其抑制HCC生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2.觀察重組腺病毒介導(dǎo)TIMPl基因?qū)CC細(xì)胞侵襲性的影響，探討其抑制HCC細(xì)胞侵襲性的作用機(jī)理。 3.觀察重

6、組腺病毒介導(dǎo)TIMPl基因?qū)铙wHCC生長(zhǎng)的影響，探討rAAV2-TIMP1抑制活體HCC的效能及rhhV2-TIMPl對(duì)HCC的治療潛力。 研究?jī)?nèi)容： 1.攜帶人全長(zhǎng)TIMP1基因cDNA的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建 1.1 人TIMP1基因全長(zhǎng)cDNA的選擇與提取 從Genbank查獲人TIMP1基因全序列，進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)；從HCC組織中提取總 mRNA，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse-tra

7、nscription polymerase chain reaction，RT-PCR)擴(kuò)增TIMPl基因全長(zhǎng)eDNA。 1.2 攜帶全長(zhǎng)TIMP1基因cDNA的重組腺相關(guān)病毒r從V2-TINPl的構(gòu)建： ①TIMP-1基因cDNA片段定向克隆到pMD18-T質(zhì)粒，得重組質(zhì)粒命名為 pMDl8-T-TIMP1。將pMD18-T-TIMPl轉(zhuǎn)入Top10中。篩選和鑒定重組子，用 EcoR I/BamH I雙酶切鑒定，并送上

8、海申能博彩有限公司進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。 ②rAAV2載體pSNAV,TIMP1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：將測(cè)序正確的pMD18-T-TIMPl重組子大規(guī)模擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA，用EcoR I/BamH I雙酶切切下TIMP-1全長(zhǎng)510bp cDNA，正向插入pSNAV載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，得到的重組質(zhì)粒命名為pSNVA-TIMPl。 ③rAAV2-TIMP1病毒細(xì)胞株的建立用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pSNVA-TIMPl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BH

9、K-21細(xì)胞，將細(xì)胞株命名為BHK-21/rAAV2-TIMP1。 ④AAV2-TIMP1重組病毒的制備與純化，先進(jìn)行重組AAV2病毒rhAV2-TIMP1的包裝：用具有rAAV2包裝功能的1型單純皰疹病毒(HSVl一rc/△UL2)感染BHK-TIMP1。首先大量擴(kuò)增BHK-21／rAAV2-TIMP1細(xì)胞及輔助病毒 rHSVl-rc／△UL2，用rHSV1-rc／△UL2(MOI為1．O)感染BHK-21／r從V2-TIMP

10、l細(xì)胞，待細(xì)胞完全病變后收集細(xì)胞及上清液。初步純化，獲得rAAV2-TIMP1，再用親和層析、離子交換層析和分子篩層析進(jìn)一步精純化。 ⑤rAAV2-TIMPl的純度的檢測(cè)：用SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)法檢測(cè) rAAV2-TIMP1的純度，rMiV2-TIMPl純度采用凝膠掃描圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行。再對(duì)純化的rAAV2-TIMP1病毒樣品行高壓液相(HPLC)分析。 ⑥r(nóng)AAV2-TIMP1重組病毒的滴度測(cè)定：

11、用點(diǎn)雜交方法檢測(cè)純化rAAV2-TIMP1的滴度。同時(shí)，構(gòu)建空白腺相關(guān)病毒(r從V2-luc，無TIMP1)作為對(duì)照。 2.rAAV2-TIMP1抑制HCC細(xì)胞侵襲的細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 2.1 rAAV2-TIHPl抑制HCC細(xì)胞株侵襲的實(shí)驗(yàn) 分別用感染復(fù)數(shù)(multiplicities of infection，MOI)為100的rAAV2-TIMP1和rAAV2-luc感染人肝癌細(xì)胞(Bel-7402)。用侵襲小室(B

12、oydenchamber)檢測(cè)Bel-7402細(xì)胞侵襲人工基底膜(Matrigel)的能力。 2.2 rAAV2-TIMPl抑制HCC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 用MTT法檢測(cè)HCG細(xì)胞Bel-7402細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，確定rAAV2-TIMP1 對(duì) Bel-7402細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 2.3 rAAV2-TIMP1抑制HCC細(xì)胞的生產(chǎn)和促進(jìn)凋亡 用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)感染rAAV2-TIMP1的Bel-7402細(xì)胞生長(zhǎng)

13、指數(shù)和凋亡指數(shù)。 2.4 RT-PCR檢測(cè)感染rAAV2-TIMP1后Bel-7402細(xì)胞中TIHP1 mRNA的變化 2.5 Western bIot法檢測(cè)感染rAAV2-TIMP1對(duì)HCC細(xì)胞分泌TINP1蛋白表達(dá)的影響 用Western blot檢測(cè)Bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)液中TIMP1蛋白的表達(dá)，以確定感染rAAV2-TIMP1的HCC細(xì)胞株(Bel-7402)分泌TIMP1蛋白的變化。 3.動(dòng)物

14、實(shí)驗(yàn) 3.1成瘤實(shí)驗(yàn) 用100 MOI的rAAV2-TIMP1感染Bel-7402細(xì)胞，然后注射入裸鼠皮下組織成瘤，觀察rMV2-TIMPl對(duì)HCC成瘤的影響。以rMV2-luc為對(duì)照。 3.2治療實(shí)驗(yàn) 用rMV2-TIMP1對(duì)已成瘤的HCC行瘤內(nèi)注射，觀察rMV2-TIMP1對(duì)HCC的治療作用，以瘤內(nèi)注射PBS為對(duì)照。 3.3組織學(xué)檢測(cè) 所有實(shí)驗(yàn)HCC行病理切片，HE(hematoxyl

15、in eosin)染色，觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu)；免疫組化染色檢測(cè)TIMP-1基因在荷瘤鼠組織中的表達(dá)。 結(jié)果： 1.成功地從HCC組織中提取并擴(kuò)增出全長(zhǎng)TIMP1基因cDNA，經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)該基因片段序列與Genbank中人類TIMP1基因序列完全一致。 2.成功地構(gòu)建出攜帶人類TIMP1 基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV2-TIMP1，病毒滴度達(dá)1×10<'12>v．g/ml。 3.受rAAV2-TIMP1感染

16、的Bel-7402細(xì)胞穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)下降52％。 4 受rAAV2-TIMP1感染的Bel-7402細(xì)胞分泌TIMP1的能力明顯增強(qiáng)且持續(xù)表達(dá)。 5 受rAAV2-TIMP1感染的Bel-7402細(xì)胞的成瘤能力下降，瘤內(nèi)注射rAAV2-TIMP1使瘤體生長(zhǎng)緩慢。 結(jié)論：攜帶人TIMP1全長(zhǎng)cDNA的重組腺相關(guān)病毒rAAV2-TIMP1．體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)能夠穩(wěn)定高效地表達(dá)TIMP-1。rAAV2-