重組腺病毒介導(dǎo)反義MMP2基因抑制肝癌生長(zhǎng)和侵襲的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的①構(gòu)建攜帶反義MMP2基因片段的重組腺病毒Ad-MMP2AS，為探討抑制肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。②分析重組腺病毒介導(dǎo)反義MMP2基因?qū)θ薍CC細(xì)胞侵襲性的抑制作用，探討抑制作用的機(jī)理。③觀察重組腺病毒介導(dǎo)反義MMP2基因?qū)θ搜軆?nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcell,VEC)生長(zhǎng)的作用，探討它抑制腫瘤血管生成的機(jī)理，進(jìn)一步探討其抑制HCC

2、生長(zhǎng)的機(jī)理。④觀察重組腺病毒介導(dǎo)反義MMP2基因?qū)铙wHCC的抑制作用，探討Ad-MMP2AS對(duì)HCC的治療潛力。 方法從Genbank查得二型基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase-2，MMP2)基因cDNA全序列，選擇5'端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近長(zhǎng)約500bp的基因段為目的基因片段，設(shè)計(jì)特異性克隆引物。從人肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)組織中提取總RNA，以總RNA為模板

3、用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)擴(kuò)增MMP2基因片段。將經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)為正確的基因片段反向克隆到重組腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)中的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV的多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite,MCS)，構(gòu)建出攜帶反義MMP2基因片段的重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-MMP2AS；再將pAdTrack-CMV-MMP

4、2AS與重組腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)中的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183內(nèi)進(jìn)行同源重組，經(jīng)293細(xì)胞包裝生成攜帶反義MMP2基因片段的重組腺病毒Ad-MMP2AS。同時(shí)，構(gòu)建空白病毒(Ad-CMV)作為對(duì)照。用逐步稀釋法通過熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)發(fā)綠色熒光的點(diǎn)數(shù)(expression-formingunits，efu)，檢測(cè)綠色熒光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)的表達(dá)，確定Ad-MMP2AS

5、和Ad-CMV的滴度。用感染復(fù)數(shù)(multiplicitiesofinfection，MOI)為100的Ad-MMP2AS和Ad-CMV分別感染人肝癌細(xì)胞株(Bel-7402)和人血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcell,VEC)：①用明膠酶譜分析(Gelatinzymography)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP2的活性；②用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP2蛋白的表達(dá)；③用侵襲小室(Boydenchamber

6、)檢測(cè)細(xì)胞侵襲人工基底膜(Matrigel)的能力；④用MTT法、流式細(xì)胞儀(FCM)和電鏡分別檢測(cè)感染Ad-MMP2AS的VEC的生長(zhǎng)情況和細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化；⑤裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察Ad-MMP2AS的Bel-7402細(xì)胞的成瘤情況；⑥用Ad-MMP2AS和Ad-CMV分別治療腫瘤，觀察它們的治療作用；⑦腫瘤組織病理切片、HE(hematoxylineosin)染色，觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu)；⑧用抗CD31單克隆抗體(monoclonalantibo

7、dy，mAb)檢測(cè)腫瘤組織中血管密度。用標(biāo)準(zhǔn)差t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果①成功地從HCC組織中提取并擴(kuò)增出500bp的MMP2基因片段，經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)該基因片段序列與Genbank中MMP2基因cDNA序列5'端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近500bp的基因序列完全一致；②成功地構(gòu)建出攜帶反義MMP2基因片段的重組腺炳毒Ad-MMP2AS，病毒滴度＞1×108efu/ml；③受Ad-MMP2AS感染的B

8、el-7402細(xì)胞穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)下降52％；④受Ad-MMP2AS感染的Bel-7402細(xì)胞分泌MMP2的能力明顯被抑制；⑤受Ad-MMP2AS感染的VEC出現(xiàn)凋亡指數(shù)升高、生長(zhǎng)指數(shù)下降；⑥受Ad-MMP2AS感染的Bel-7402細(xì)胞的成瘤量下降4.3倍，瘤內(nèi)注射Ad-MMP2AS使瘤體生長(zhǎng)減少63％；⑦經(jīng)Ad-MMP2AS處理的腫瘤細(xì)胞核分裂相減少、細(xì)胞萎縮和較多的細(xì)胞壞死，腫瘤內(nèi)微血管密度較對(duì)照組減少2.6倍。