剪接因子SR蛋白和hnRNPA1對糖皮質(zhì)激素受體外顯子9選擇性剪接調(diào)控的影響.pdf

1、背景 糖皮質(zhì)激素抵抗是臨床上包括哮喘在內(nèi)的許多慢性炎癥性疾病的治療難題，而人類對激素抵抗的分子機(jī)制仍然還未完全研究清楚。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體beta]E型(hGRβ)相對于alpha,]E型(hGRQ)的過度表達(dá)與激素抵抗密切相關(guān)。人糖皮質(zhì)激素受體外顯子9的選擇性剪接產(chǎn)生兩種高度同源的剪接異構(gòu)體，hGRα和hGRβ。在mRNA水平上，兩者含有完全相同的前8個(gè)外顯子，反映在氨基酸序列上，兩者在氨基端有相同的727個(gè)氨基

2、酸。唯一的差別在剩余的羧基端部分：hGRQ的羧基端由外顯子9a編碼的50個(gè)氨基酸組成，而hGRβ的羧基端由外顯子9β編碼的的15個(gè)非同源氨基酸組成。這些結(jié)構(gòu)上的差別使得hGRβ在功能上無法結(jié)合糖皮質(zhì)激素，降低了與DNA結(jié)合的能力，使之喪失基因轉(zhuǎn)錄激活作用。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，過度表達(dá)的hGRB與hGRQ形成異源二聚體從而抑制hGRQ介導(dǎo)的的轉(zhuǎn)錄激活作用。因此hGRβ被認(rèn)為是hGRα功能的主要拮抗因子。 富含絲氨酸／精氨酸的蛋白(SRp

3、rotein)和hnRNPAl是真核生物中重要的剪接因子。它們在剪接位點(diǎn)的識別，外顯子保留，以及剪接位點(diǎn)的相互作用上發(fā)揮著重要的作用，因而成為研究前體mRNA選擇性剪接的重要候選因子。 考慮到hGRβ與激素抵抗密切關(guān)系，因此研究糖皮質(zhì)激素受體前體mRNA外顯子9的選擇性剪接機(jī)制，找到?jīng)Q定hGRB剪接的關(guān)鍵因素對于揭開激素抵抗的分子機(jī)制具有重要意義，并能為激素抵抗的臨床治療提供可能的靶點(diǎn)。盡管有研究報(bào)道SR蛋白成員SRp30c對h

4、GRβ的選擇性剪接具有決定性作用，但大量hGR外顯子9選擇性剪接的調(diào)控機(jī)制仍不為人所知。 目的 1．構(gòu)建hGR小基因報(bào)告載體，為進(jìn)一步研究糖皮質(zhì)激素受體外顯子9的選擇性剪接提供分子模型。 2．以hGR小基因報(bào)告載體作為模型，研究剪接因子SR蛋白及hnRNPAl對糖皮質(zhì)激素受體外顯子9選擇性剪接的影響，尋找決定hgRβ剪接的關(guān)鍵因子。 方法 以人基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得3

5、．892kb長的hGR小基因片段，并將其連入pMDl8一TSimple載體中，經(jīng)限制性酶切鑒定后，hGR小基因片斷被亞克隆到PcDNA3載體中，獲得hGR小基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，測序驗(yàn)證后命名為pcDNA3-hGR。將hGR小基因報(bào)告質(zhì)粒分別與不同的SR蛋白和hnRNPAl表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa、293T細(xì)胞。24小時(shí)后收獲細(xì)胞，用RT一PCR半定量檢測被剪接的小基因產(chǎn)物hGRQ／hGRB的表達(dá)比值。 結(jié)果 1．限制性酶切

6、鑒定 用XhoI，BamHI雙酶切pcDNA3-hGR及pMDl8-T—hGR，分別得到5．4kb和2．692kb的載體片斷及3．892kb的小基因片斷，結(jié)果與理論上預(yù)期的相符。 2．DNA測序 測序結(jié)果顯示克隆的hGR小基因片斷與Genabank上的目標(biāo)序列一致性為99．5％，極少數(shù)¨．I于突變或測序時(shí)誤讀所導(dǎo)致的堿基改變對不會對剪接造成影響。 3．hGR小基因在HeLa細(xì)胞中的表達(dá) RT—PC

7、R擴(kuò)增出了表達(dá)量豐富的hGRQ(約547bp)和表達(dá)量很少的hGRD(約353bp)兩種轉(zhuǎn)錄自hGR小基因的剪接異構(gòu)體，而用同樣的引物無法擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)源性hGRQ，hGRB剪接異構(gòu)體。 4．剪接因子SR蛋白家族成員和hnRNPAl對hGR外顯子9選擇性剪接的影響 與空載體對照相比，SRp40能促進(jìn)剪接時(shí)外顯子9Q的“跳躍”，而導(dǎo)致外顯子9β的識別增加，使hGRQ的表達(dá)百分比明顯下降(39％)而hgRβ的表達(dá)百分比明顯升高

8、(61％)，兩者的比值出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)(P<0．01)。而包括SRp30c在內(nèi)的其他剪接因子與空載體對照在hGR，h6Rβ表達(dá)上的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0．05)。 5．SRp40對hGRβ的剪接促進(jìn)作用具有細(xì)胞特異 隨著HeLa細(xì)胞中SRp40質(zhì)粒濃度的不斷增加，剪接識別機(jī)制對外顯子9a的“跳躍”也不斷增加。呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴關(guān)系。而這種由SRp40誘導(dǎo)的外顯子9Q的“跳躍”在293Tce¨s中并沒有觀察到。同樣在兩種細(xì)