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文檔簡介
1、凝血因子Ⅷ(FⅧ)作為血友病患者維持生命的必須藥品,原料來源是人類血漿,而我國血漿供應(yīng)不足的狀況造成FⅧ制品供應(yīng)嚴(yán)重不足,因此,改進(jìn)從人血漿中分離純化FⅧ的生產(chǎn)工藝,提高國內(nèi)產(chǎn)量是十分必要的。
本文以血漿冷沉淀為基礎(chǔ),采用層析法分離FⅧ;比較了凝膠過濾、離子交換層析、疏水層析三種層析法從冷沉淀溶液中分離FⅧ的效果,從活性收率和純化倍數(shù)兩個方面比較得出疏水層析對FⅧ這種大分子強(qiáng)疏水性蛋白有較好分離效果;且疏水分離機(jī)制利于保持
2、FⅧ活性;并通過制一系列不同配基密度的介質(zhì)以證實(shí)低配基密度介質(zhì)有利于在層析過程中保持大分子蛋白活性這一現(xiàn)象。
在此基礎(chǔ)上對疏水層析分離條件進(jìn)行優(yōu)化,最終確定層析條件如下:
疏水介質(zhì):Phenyl sepharose 6FF,配基密度20μ mol/ml介質(zhì);
上樣量:冷沉淀溶液二次離心后上清(13.66mg蛋白/ml介質(zhì));
上樣流速:1ml/min;
洗脫方式:0~
3、100%B液線性洗脫5個柱體積;
反應(yīng)溫度:25℃
A液:20mM檸檬酸緩沖液+1mM氯化鈣+120mM甘氨酸+1M硫酸銨,pH6.6;
B液:20mM檸檬酸緩沖液+1mM氯化鈣+120mM甘氨酸,pH6.6。
最終得到洗脫峰中FⅧ活性收率62%,相對于原血漿純化倍數(shù)96倍,證明了在優(yōu)化后的層析條件下可以獲得高濃度的FⅧ樣品,使用低配基密度介質(zhì)利于保持目標(biāo)蛋白活性,為進(jìn)一步生產(chǎn)FⅧ
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