肝細(xì)胞移植對(duì)裸鼠肝銅代謝的影響.pdf

1、目的:1.通過(guò)銅負(fù)荷飲食法建立裸鼠的肝臟銅代謝異常疾病模型，分離同種裸鼠肝細(xì)胞懸液，予以腹腔內(nèi)移植，研究肝細(xì)胞移植對(duì)裸鼠銅代謝的影響;2.通過(guò)檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化物質(zhì)細(xì)胞色素P450(cytochrome protein P450，CYP450)、肝丙二醛(MDA)、裸鼠肝組織氧活性簇(ROS)及超氧化物歧化酶(SOD)的變化，探討移植肝細(xì)胞影響裸鼠肝銅代謝的可能機(jī)制。
　　方法:1.裸鼠肝臟銅代謝異常疾病模型的建立:裸鼠（4周齡，體重

2、23±2.3g），于SPF級(jí)無(wú)菌動(dòng)物飼養(yǎng)房正常飼養(yǎng)10天適應(yīng)環(huán)境后，采用銅飲食負(fù)荷法造模，喂飼混有硫酸銅1.0g/kg的飼料和0.185％的硫酸銅水4周。通過(guò)代謝籠收集裸鼠24小時(shí)尿液測(cè)定尿銅值，抽血做肝功能檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)模型的建立。2.實(shí)驗(yàn)分組:將40只裸鼠肝銅代謝異常模型隨機(jī)分為2組，肝細(xì)胞移植組（組1）及腹腔肝細(xì)胞培養(yǎng)液注射組（組2），每組各20只。取20只未造模裸鼠（同齡正常飲食飲水裸鼠）行肝細(xì)胞移植做正常代謝對(duì)照組（組3）。另取4

3、0只同齡裸鼠作1對(duì)1肝細(xì)胞移植的供體。3.裸鼠移植肝細(xì)胞懸液制備及實(shí)驗(yàn)干預(yù)。4.實(shí)驗(yàn)檢測(cè):分別在細(xì)胞移植前1h，移植后3d，7d，14d，28d對(duì)三組裸鼠心臟穿刺抽血0.1ml行肝功(ALT、ALB、AST)檢測(cè)、血清銅(serumcopper)含量測(cè)定、血清銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin，CP)測(cè)定。在術(shù)后7天、28天分別對(duì)3組裸鼠行活檢取部分肝組織，所取肝組織制成細(xì)胞勻漿檢測(cè)肝臟銅含量，ELISA測(cè)細(xì)胞色素P4502E1蛋白表

4、達(dá)變化，肝組織勻漿的SOD活性，肝組織MDA含量，肝組織活性氧簇(ROS)濃度變化。移植后28天時(shí)行肝組織和移植細(xì)胞活檢，肝組織以10％的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，采用HE染色后，于光學(xué)顯微鏡下行病理學(xué)檢測(cè)及肝銅染色。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，計(jì)數(shù)資料采用率和構(gòu)成比描述;兩組間的比較采用t分析;檢驗(yàn)水準(zhǔn)(a)設(shè)定為0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組間比較采用方差設(shè)計(jì)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)

5、(a)設(shè)定為0.05，P＜0.05，上述統(tǒng)計(jì)分析均由SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。
　　結(jié)果:1.通過(guò)銅負(fù)荷飲食后，建模組血清銅（4.38±0.17μg/ml）明顯高于正常喂養(yǎng)組（1.05±0.05μg/ml）（P＜0.05），建模組尿銅數(shù)值（137.6±13.4μg/24h）明顯高于正常喂養(yǎng)組尿銅值(25.5±6.1μg/24h)（P＜0.05）。銅過(guò)量負(fù)荷后，建模組肝功檢測(cè)ALT、AST數(shù)值明顯高于正常喂養(yǎng)組(P＜0.05)，

6、建模組蛋白合成水平ALB低于較正常喂養(yǎng)組（P＜0.05）。
　　2.裸鼠移植肝細(xì)胞懸液制備良好，光鏡下見(jiàn)典型肝細(xì)胞特征，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活性大于90％。術(shù)后三組裸鼠于28d活檢時(shí)均無(wú)死亡。28天活檢時(shí)候可見(jiàn)組1、組3裸鼠腹腔內(nèi)生長(zhǎng)的肝細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞團(tuán)塊活檢HE染色于光鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)良好。
　　3.術(shù)前、術(shù)后組1、組2各時(shí)間點(diǎn)AST、ALT、血清銅均明顯高于組3，蛋白合成水平及血清銅藍(lán)蛋白含量均低于組3，有顯著差異性（P＜0

7、.05）。移植術(shù)前1h組1裸鼠AST、ALT、ALB、血清銅、血清銅藍(lán)蛋白檢測(cè)結(jié)果與組2比較無(wú)明顯差異性（P＞0.05），組1術(shù)后3d，7d、14d、28d時(shí)AST、ALT、ALB、血清銅、肝銅藍(lán)蛋白檢測(cè)結(jié)果與組2比較有顯著差異性（P＜0.05）。術(shù)后28d所測(cè)組1肝銅含量（35.97±1.45μg/g）明顯低于組2肝銅水平（53.30±3.17μg/g）(P＜0.05)。
　　4.裸鼠肝組織病理學(xué)檢測(cè):干預(yù)后28d，組1肝組織肝

8、細(xì)胞結(jié)構(gòu)略顯混亂，輕微水腫，肝細(xì)胞呈條索狀排列，可見(jiàn)少量點(diǎn)狀壞死肝細(xì)胞，少量肝細(xì)胞核濃縮深染，有的細(xì)胞核溶解消失。組2可見(jiàn)自身肝臟肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、氣球樣變、脂肪樣變，肝細(xì)胞內(nèi)缺少胞漿存在，代之以大小不等的空泡，肝細(xì)胞核被推向細(xì)胞周圍或居中央而壞死消失。組3細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，相鄰的肝板相互吻合連接，可見(jiàn)所取標(biāo)本肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，胞質(zhì)、胞核完整，肝細(xì)胞無(wú)明顯病變表現(xiàn)。采用紅氨酸

9、銅染色法對(duì)28d組1，組2肝臟切片進(jìn)行銅染色。組1的肝細(xì)胞內(nèi)銅顆粒沉積明顯少于組2。
　　5.干預(yù)后28d，組1 CYP4502E1水平(0.95±0.02 nmol/mg)低于組2水平(2.41±0.06 nmol/mg)(P＜0.05)，組1 MDA含量(4.25±0.14 nmol/mg)低于組2水平(7.72±0.10 nmol/mg)(P＜0.05)，組1 ROS含量(11.28±1.26nmo1/mg)低于組2水平(2