脂肪基質細胞移植對裸鼠后肢缺血治療作用的分子影像研究.pdf

1、研究背景和目的
　　外周動脈疾?。╬eripheralarterialdisease，PAD）以下肢動脈阻塞為特點，在老齡、吸煙、動脈粥樣硬化和糖尿病人群中患病率極高。嚴重PAD患者多無外科或介入血運重建術的適應證，且長期預后不良。大量研究證實骨髓來源的干、祖細胞移植有助于促進缺血肢體的血管生成，改善側支代償和血流灌注，為PAD治療帶來新的希望。然而，骨髓作為最常見的細胞來源，其足量獲取存在一定的局限；此外，組織學等常規(guī)方法難以實

2、現(xiàn)對體內(nèi)移植細胞的連續(xù)監(jiān)測，因此不足以闡明細胞移植的確切治療效果。
　　本實驗以前期研究為基礎，選取β-Actin-luc轉基因小鼠的脂肪組織為細胞來源，首先嘗試體外培養(yǎng)穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶（fireflyluciferase，F(xiàn)luc）報告基因的脂肪基質細胞（adiposederivedstromalcells，ADSCs），并建立無胸腺裸鼠后肢缺血的PAD動物模型。然后，將體外培養(yǎng)的ADSCs移植入PAD模型裸鼠的缺血后肢進

3、行治療，并運用報告基因Fluc生物發(fā)光成像對ADSCs進行在體無創(chuàng)示蹤，評價ADSCs的體內(nèi)轉歸；同時采用激光多普勒血流成像等方法監(jiān)測缺血后肢的血流灌注與血管生成。研究旨在為ADSCs對PAD肢體缺血的治療作用提供進一步證據(jù)。
　　研究方法
　　FVB來源的β-Actin-luc轉基因小鼠繁殖后進行生物發(fā)光成像，篩選出Fluc陽性子代繼續(xù)繁殖，直至穩(wěn)定攜帶該報告基因。無菌分離攜帶β-Actin-luc小鼠的脂肪組織，采用改良

4、膠原酶消化法，分離出脂肪組織中的基質血管部分，使用常規(guī)間充質基質細胞（MSC）培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)，取貼壁細胞為原代ADSCs，繼續(xù)消化傳代。收集第3代ADSCs，采用CD44-PE、CD34-PE、CD31-PE、CD45-PE、CD90-APC單克隆抗體進行免疫表型的流式細胞學鑒定。運用體外生物發(fā)光成像鑒定ADSCs的Fluc表達；進一步將ADSCs（1×106）植入無胸腺BALB/c裸鼠的后肢肌肉中，鑒定細胞的體內(nèi)生物發(fā)光情況。

5、r>　　PAD模型建立于雄性無胸腺BALB/c裸鼠（n=40），采用結扎裸鼠單側股動脈近端和遠端，并移除兩端之間的股動脈節(jié)段及其所有分支的方法。PAD模型裸鼠隨機分為ADSCs組（n=20）或PBS組（n=20），分別將體外擴增的ADSCs（1×106）或PBS注入裸鼠的缺血后肢肌肉中，同時設立不行股動脈結扎術的空白對照組（n=10），或僅分離而不結扎股動脈的假手術組（n=10）。運用Fluc生物發(fā)光成像對體內(nèi)ADSCs進行示蹤，激光多

6、普勒血流灌注成像（LDPI）用于監(jiān)測缺血肢體的微循環(huán)血流變化，采用自身對照和相對LDPI指數(shù)定量。免疫組織化學法用于檢測血管生成情況，同時計算裸鼠發(fā)生跛行、自截肢的百分率。
　　研究結果
　　報告基因光學成像顯示，篩選繁殖出的轉基因小鼠近交系穩(wěn)定攜帶β-Actin-luc，由其脂肪組織中分離培養(yǎng)的基質細胞高表達CD90（98.9％）及CD44（89.7％）等MSC的表面標志，而CD45、CD34和CD31呈現(xiàn)無或低表達（<5

7、.0％），證實ADSCs具有MSC的表型特點。生物發(fā)光成像證實，體外培養(yǎng)的ADSCs其細胞的絕對數(shù)量與Fluc平均輻射度成正直線相關關系（相關系數(shù)r2=0.94）。裸鼠后肢肌肉內(nèi)移植的ADSCs，其Fluc平均輻射度在熒光素腹腔注射后0-42min內(nèi)先迅速增強后平緩減弱，21min時最強，達（6.92×106±4.11×105）P·s-1·cm-2·sr-1。
　　PAD模型建立后，裸鼠缺血后肢與空白對照組、假手術組對應的后肢相比

8、，LDPI指數(shù)明顯降低，表明所采用術式具有良好的血流阻斷效果。體內(nèi)生物發(fā)光成像證實，在細胞移植后35天內(nèi)，ADSCs組裸鼠的缺血后肢均顯示Fluc生物發(fā)光信號，平均輻射度最強達（6.59×106±1.02×106）P·s-1·cm-2·sr-1，第35天減弱至（2.50×105±1.66×105）P·s-1·cm-2·sr-1，表明ADSCs可在缺血后肢移植后的有限時間內(nèi)存活，但數(shù)量逐漸減少。LDPI成像監(jiān)測顯示，細胞移植后ADSCs組

9、和PBS組缺血后肢的相對LDPI指數(shù)均逐漸增強，跛行情況改善，但ADSCs組更為顯著（P<0.05），證實ADSCs移植較PBS可進一步改善缺血后肢的微循環(huán)血流灌注，并改善患肢跛行，減少自截肢的發(fā)生。缺血肢體肌肉組織的CD31染色表明，ADSCs組具有更高的毛細血管密度。
　　研究結論
　　1.β-Actin-Fluc轉基因FVB小鼠脂肪組織中分離的基質細胞（ADSC）高表達MSC的表面標志，可在體外和移植后穩(wěn)定表達報告基因