攜帶外源基因的復制型HBV載體的構建.pdf

1、背景和目的:
　　將病毒載體設計成能夠攜帶外源基因并按著親代病毒的侵入路徑到達細胞體內的病毒變異體是病毒載體研究的新思路。對一些病毒家族來說,攜帶報告基因的復制型載體能夠在簡化和量化檢測復制和感染、識別抗病毒和病毒易感細胞等方面成為有力的工具。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV),是引起乙型病毒性肝炎的小包裹DNA病毒,原則上在這個僅有3.2kb的基因組內插入外源基因不可避免地會影響本身的復制元件。HBV復制子通

2、過前基因組RNA(pregenomicRNA,pgRNA)逆轉錄而來,pgRNA作為雙順反子mRNA,在形成核心蛋白(C)和逆轉錄酶(Pol)方面也是必需的,C和Pol開放讀碼框架(openreadingframes,ORF)有150bp的重疊區(qū)。PolORF的下游區(qū)翻譯一般不涉及內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)。我們設想將C、P重疊區(qū)域拉開,插入兩個IRES分別用于表達外源基因和

3、P蛋白,產生一個有功能的且不影響包膜蛋白表達的三順反子pgRNA。為了減少對基因組長度的影響,我們利用僅含22個nt的RNA結合基序蛋白3(RNA-binding motif protein3,Rbm3)IRES,構建了分別攜帶399bp的殺稻瘟菌素抗性基因(blasticidin resistance,BsdR)和720bp的人綠色熒光蛋白(humanized Renilla green fluorescent protein,hrG

4、FP)的HBV載體,研究發(fā)現仍有復制能力,能產生同野生型HBV一樣的病毒蛋白,所形成的的病毒顆粒可用于感染HepRG細胞。這種新型的攜帶外源基因的HBV載體將成為研究HBV的有力工具。
　　方法:本課題分三部分進行探討。
　　第一部分:22-ntRbm3IRES在HBV前基因組RNA上的表達活性研究
　　1、構建攜帶CMV啟動子和增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,

5、EGFP)的四種質粒:I:pCH-EMCVIRES-EGFP(包含腦炎心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)IRES及EGFP);II:pCH-22ntIRES-EGFP(包含Rbm3IRES及EGFP);III:pCH-BsdR-22ntIRES-EGFP(為三順反子載體,依次包含Rbm3IRES,BsdR,Rbm3IRES及EGFP);IV:pCH-pATG-EGFP(包含HBVC基因N端部分與

6、EGFP)。ELISA檢測I、II、III載體轉染HepG2或Huh7細胞后72h的上清液中HBeAg的表達,并觀察四種載體轉染后EGFP的表達。
　　2、構建攜帶HBVC基因啟動子和熒光素酶基因(Renillaluciferase,RLuc)的四種質粒:I:pHBV-EMCVIRES-RLuc(包含EMCVIRES及RLuc);II:pHBV-22ntIRES-RLuc(包含Rbm3IRES及RLuc);III:pHBV-Bsd

7、R-22ntIRES-RLuc(為三順反子載體,依次包含Rbm3IRES,BsdR,Rbm3IRES及RLuc);IV:pHBV-pATG-RLuc(包含HBVC基因N端部分與RLuc)。四種質粒分別同對照質粒pGL3-Control共轉染HepG2或Huh7細胞,通過雙熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶值。
　　第二部分:復制型HBV載體的構建及其表達與復制能力研究
　　構建兩種復制型HBV載體:pCH-BsdR和pCH-hr

8、GFP。兩個質粒和攜帶野生型HBV的質粒pCH-3093分別轉染肝癌細胞系HepG2和Huh7細胞。通過熒光顯微鏡觀察外源基因hrGFP的表達,Bsd篩選細胞克隆。Northernblot檢測質粒轉染細胞后RNA的表達。Westernblot、Nativewesternblot分別用于檢測HBV包膜、核心蛋白和組裝的核心顆粒。ELISA測定細胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平。內源性聚合酶反應(endogenous polymera

9、se reaction,EPR)檢測功能性P蛋白表達。Southernblot檢測HBV復制中間體。熒光定量PCR法分析細胞上清液中HBVDNA含量。CsCl密度梯度離心法分離細胞上清液中的病毒顆粒。
　　第三部分:復制型HBV載體的感染特性研究
　　野生型HBV質粒pCH-3093、pCH-BsdR和pCH-hrGFP分別轉染HepG2細胞,通過聚乙二醇8000沉淀上清中的重組病毒顆粒,用于感染HepRG細胞,感染8天后,

10、經Northernblot檢測HBVRNA的水平,ELISA測定細胞上清液中的HBsAg和HBeAg。病毒顆粒與高效價HBV免疫球蛋白(hepatitis Bimmuno-globulin,HBIG)預孵育1h后再感染HepRG細胞以驗證重組HBV顆粒是否能被抗體阻斷。
　　結果:
　　第一部分:22-ntRbm3IRES在HBV前基因組RNA上的表達活性研究
　　1、I、II、III號載體轉染HepG2和Huh7后,

11、HBeAg表達均無顯著差異。從第一組質粒轉染HepG2后觀察熒光強度分析,攜帶Rbm3IRES雙順反子載體(II)中Rbm3IRES的翻譯起始效率明顯強于EMCVIRES(I);相對于雙順反子載體(II),在三順反子載體上(III)串聯的第二個Rbm3IRES引導的EGFP表達強度下降較多;但是仍明顯高于HBV自身翻譯起始序列引導的EGFP表達水平(IV)。
　　2、從第二組質粒分別轉染HepG2和Huh7細胞后有相似的熒光素酶結

12、果,Rbm3IRES產生的熒光素酶活性(II)為EMCVIRES產生熒光素酶活性(I)的兩倍有余(IIVSI,P<0.01)。三順反子載體上Rbm3IRES產生的熒光素酶活性較雙順反子明顯下降(IIIVS
　　II,P<0.01),但是仍明顯高于HBV自身翻譯起始序列產生的熒光素酶活性(IIIVSIV,P<0.05)。
　　第二部分:復制型HBV載體的構建及其表達與復制能力研究
　　成功構建HBV載體pCH-BsdR和

13、pCH-hrGFP。轉染細胞后能觀察到高水平綠色熒光蛋白表達,經Bsd篩選可形成穩(wěn)定的Bsd抗性細胞克隆。均可產生攜帶外源基因的pgRNA,有同野生型HBV相似的核心和包膜蛋白,載體之間HBsAg和HBeAg的分泌量無明顯差異。BsdR載體轉染細胞后能翻譯出有功能的P蛋白。BsdR載體的復制能力為野生型HBV的40％,hrGFP載體復制能力明顯減弱。然而,這兩個載體都能夠形成有包膜的病毒。
　　第三部分:復制型HBV載體的感染特性

14、研究
　　利用pCH-BsdR和pCH-hrGFP能夠制備重組病毒顆粒,能夠感染HepRG細胞。感染8天后,Northernblot可以檢測到前基因組和亞基因病毒RNA,ELISA測定出同野生型HBV一樣的HBsAg和HBeAg的分泌趨勢,HBV-hrGFP病毒感染HepRG后可以檢測到hrGFP的表達。通過抗體阻斷實驗證實重組HBV通過與野生型HBV相同的方式(通過HBV外膜蛋白)感染HepaRG細胞。
　　結論:

15、　　1、不管是用CMV啟動子還是HBVC基因啟動子驅動,Rbm3IRES都比EMCVIRES有較高的翻譯起始效率。在HBVC基因和P基因之間插入了外源基因的三順反子載體中,串聯的兩個Rbm3IRES均有能力引導翻譯起始過程。
　　2、把C、P蛋白分開表達,利用2個僅22-nt的強效IRES分別表達外源基因和P蛋白,保持了各結構蛋白的完整性又盡量少擴充基因組容量,實現載體功能并保持復制能力。
　　3、利用構建的HBV載體制備的