人呼吸道合胞病毒M蛋白非復(fù)制型重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、目的：人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)廣泛分布于世界各地，是導(dǎo)致嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。目前尚無(wú)特異性防治方法，世界衛(wèi)生組織將發(fā)展RSV疫苗列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項(xiàng)目之一。RSV的11種蛋白中，RSV的基質(zhì)蛋白(matrixprotein，M)是位于病毒包膜內(nèi)側(cè)的結(jié)構(gòu)蛋白，在RSV病毒形態(tài)發(fā)生上具有重要作用，同時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。為進(jìn)一步開(kāi)展M蛋白

2、的功能研究及尋求RSV疫苗研制的新方法，我們克隆了RSV M基因并完成了可表達(dá)RSV M蛋白的非復(fù)制型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定。 方法：根據(jù)編碼M蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR從感染RSV的HEp-2細(xì)胞中擴(kuò)增獲得M蛋白基因，克隆到pGEM-T Easy載體中，序列測(cè)定正確后，將其亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，并進(jìn)行酶切鑒定，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，應(yīng)用Western blotting方法分析M基因表

3、達(dá)情況。限制性內(nèi)切酶從pT/M中切下目的基因M，亞克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV，獲得重組穿梭質(zhì)粒pSC/M。酶切鑒定后，Pme I線性化pSC/M，利用電穿孔法轉(zhuǎn)化技術(shù)，把線性pSC/M轉(zhuǎn)入含有pAdEasy-1的大腸桿菌Ecoli BJ5183中進(jìn)行同源重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pFGAd/RSVM。酶切鑒定后，以Pac I酶切pFGAd/RSVM，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。待出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic

4、effect，CPE)后，取細(xì)胞裂解液，以Western blotting鑒定目的基因表達(dá)。 結(jié)果：重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/M的限制性內(nèi)切酶分析結(jié)果與預(yù)期一致，基因序列分析顯示RSV M基因沒(méi)有發(fā)生無(wú)義突變。轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，Western blotting分析觀察到M蛋白特異性的表達(dá)條帶。重組穿梭質(zhì)粒pSC/M和重組腺病毒質(zhì)粒pVGAd/RSVM酶切鑒定正確。pFGAd/RSVM以Pac I酶切后，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)