缺氧預適應小鼠腦勻漿液對離體細胞缺氧耐受性的影響及其可能有效組分的初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本研究通過觀察不同實驗條件對急性重復缺氧預適應小鼠模型的影響,建立穩(wěn)定可靠、效果顯著的小鼠缺氧預適應模型。由于動物對缺氧的耐受性個體差異較大,影響因素較多,因此為便于控制實驗條件和探索增強缺氧耐受性的物質(zhì)特性,本研究采用離體細胞觀察急性重復缺氧預適應小鼠腦勻漿液對離體細胞缺氧耐受性的影響。在確定急性重復缺氧預適應小鼠腦勻漿液增強不同離體培養(yǎng)細胞(PC12、HepG2以及NGF誘導分化的PC12細胞)缺氧耐受效果和有效濃度的基礎上,以NG

2、F誘導分化的PC12細胞作為觀察對象,進一步將該提取液分成蛋白部分和非蛋白部分,探討其中存在的增強細胞缺氧耐受性的可能組分。實驗分三部分進行。 方法: 第一部分:急性重復缺氧預適應小鼠模型的復制 (1).使小鼠一次性缺氧致死,以觀察小鼠缺氧致死前的變化規(guī)律。 (2).將小鼠連續(xù)4次重復缺氧,以觀察小鼠每次缺氧耐受時間的變化。 (3).將小鼠分成2組,均經(jīng)過連續(xù)4次缺氧,2組小鼠每次結(jié)束缺氧的標準分

3、別是呼吸頻率約40次/min或出現(xiàn)第1次喘呼吸,以觀察每次不同時間缺氧對小鼠缺氧耐受性的影響。 (4).將小鼠分成2組,均經(jīng)過連續(xù)4次缺氧,2組小鼠每次結(jié)束缺氧的標準分別是第一次喘呼吸或末次喘呼吸,以觀察每次不同時間缺氧對小鼠缺氧耐受性的影響。 (5).將小鼠分成4組,均經(jīng)過連續(xù)4次缺氧,但4組小鼠連續(xù)4次缺氧的環(huán)境溫度分別是:9-11℃、13-15℃、17-19℃、21-23℃,以觀察不同環(huán)境溫度對小鼠缺氧耐受性的影響

4、。 (6).將小鼠分成2組,均經(jīng)連續(xù)4次缺氧,2次缺氧間的操作時間分別是5-15s或20-30s,以觀察不同復氧時間對小鼠缺氧耐受性的影響。 (7).將連續(xù)4次缺氧的小鼠恢復常氧,30min后再放回缺氧瓶缺氧1次,以觀察小鼠缺氧耐受性的變化。 第二部分:缺氧預適應小鼠腦勻漿液對未用NGF誘導分化的PC12細胞、HepG2細胞以及NGF誘導分化的PC12細胞缺氧耐受性的影響 1.以不同濃度的小鼠腦勻漿液分別

5、作用于未用NGF誘導的PC12細胞,觀察缺氧24h、48h、72h時PC12細胞的活力、LDH透出率、早期凋亡率、晚期凋亡率的變化規(guī)律。 2.以不同濃度的小鼠腦勻漿液分別作用于HepG2細胞,觀察缺氧24h、48h、72h缺氧時HepG2細胞的活力、早期凋亡率、晚期凋亡率的變化規(guī)律。 3.僅以較低濃度范圍小鼠腦勻漿液分別作用于NGF誘導分化的PC12細胞,觀察缺氧24h、48h、72h時分化PC12細胞的活力、LDH透出

6、率,晚期凋亡率的變化規(guī)律,以探索缺氧預適應小鼠腦勻漿液對缺氧、NGF誘導分化的PC12細胞起保護作用的最適濃度。 第三部分:缺氧預適應小鼠腦勻漿液不同組分對NGF誘導分化的PC12細胞缺氧耐受性的影響及其可能有效成分的初步探討 (1).以高氯酸除蛋白法制備缺氧預適應小鼠腦勻漿去蛋白液,HPLc法測定其腺苷含量。用小鼠腦勻漿去蛋白液作用于NGF誘導分化PC12細胞,以確定去蛋白液對缺氧的分化PC12細胞有無保護作用;以小鼠

7、腦勻漿去蛋白液合并腺苷A1或A2A受體阻斷劑作用于分化PC12細胞,以確定小鼠腦勻漿去蛋白液的作用是否與腺苷有關。 (2).透析法除去缺氧預適應小鼠腦勻漿液中小分子物質(zhì),并觀察透析保留液對缺氧的分化PC12細胞有無保護作用;分別用RT-PCR、Westernblot方法檢測缺氧預適應小鼠腦組織中VEGFmRNA、VEGF的蛋白水平是否增加。用重組VEGF純品作用于分化PC12細胞,以確定透析保留液對分化PC12細胞的保護作用是否

8、與VEGF有關。 結(jié)果與討論: (一)影響急性重復缺氧模型因素 1.小鼠經(jīng)4次急性重復缺氧后,每次缺氧耐受時間顯著增加。這一結(jié)果提示,小鼠在每次缺氧后,均在體內(nèi)產(chǎn)生了增強缺氧耐受性的物質(zhì),并且各次缺氧后缺氧耐受的物質(zhì)有積累效應。 2.在小鼠出現(xiàn)第一次喘呼吸時將小鼠換入下一個缺氧瓶與小鼠呼吸頻率在40次/min時換瓶比較,可顯著提高小鼠每次耐受時間。這是因為小鼠在呼吸頻率為40次/min時,缺氧程度尚未達到

9、缺氧耐受形成的程度,因此對缺氧的耐受性也不強,因為缺氧預適應的形成需要足夠程度的缺氧。 3.在小鼠出現(xiàn)第一次喘呼吸時將小鼠換入下一個缺氧瓶與小鼠出現(xiàn)末次喘呼吸時換瓶比較,缺氧耐受時間無顯著差異。其原因是,不同小鼠喘呼吸次數(shù)不同,有的小鼠喘呼吸3-5次即死亡,有的小鼠喘呼吸卻可達30次以上,因此小鼠的個體差異較大,使組間無顯著差異,并且末次喘呼吸難以判斷,以其作為結(jié)束缺氧標準導致小鼠死亡率增加。 4.隨著環(huán)境溫度的增加,小

10、鼠的缺氧耐受時間顯著降低。這可能是因為低溫可減少小鼠體內(nèi)有害物質(zhì)的產(chǎn)生、降低代謝,有利于缺氧預適應的形成。 5.每次對小鼠換瓶操作時間長于15s會顯著降低小鼠的缺氧耐受時間。其原因可能是復氧時間太長,因為復氧時間短暫有利于預適應的形成。由于小鼠4次缺氧耐受性的完全消失需要至少30分鐘以上的時間,因此賦予預適應小鼠缺氧耐受性的物質(zhì),可能部分對機體恢復常氧供應較為敏感,但部分能維持較長時間。 (二)缺氧預適應小鼠腦勻漿液對未

11、用NGF誘導的PC12細胞、HepG2細胞、NGF誘導分化PC12細胞缺氧耐受性的影響 1.缺氧預適應小鼠腦勻漿液對缺氧、未用NGF誘導的PC12細胞、HepG2細胞缺氧耐受性的影響是:缺氧預適應小鼠腦勻漿液可顯著提高細胞對缺氧的耐受性。在缺氧初期(24h),較高濃度的保護作用顯著強于低濃度的保護作用,這提示缺氧預適應小鼠腦組織中產(chǎn)生了某種或某些可以增強細胞缺氧耐受性的物質(zhì)或使腦組織中抗缺氧成分表達增加。隨著缺氧時間延長,保護作

12、用下降,高濃度的下降更快。至缺氧72h,高濃度提取液的缺氧損傷作用顯著高于低濃度組,該結(jié)果提示,缺氧預適應小鼠腦組織中可能產(chǎn)生了半衰期較短的抗缺氧物質(zhì)及在高濃度時才顯示作用的、作用時間持久的促缺氧細胞損傷的物質(zhì),即提示缺氧預適應有著雙相效應,缺氧預適應小鼠腦勻漿的作用存在量效關系和時間效應。為此,在后續(xù)缺氧預適應小鼠腦勻漿液對分化PC12細胞的作用研究中,以蛋白濃度對提取液進行定量,并降低實驗中所用提取液的濃度范圍。 2.蛋白終

13、濃度為100.0μg/mL的缺氧預適應小鼠腦勻漿液與同濃度正常小鼠腦勻漿液比較,可顯著增強NGF誘導分化PC12細胞的缺氧耐受性,并且此濃度的缺氧預適應小鼠腦勻漿液對分化PC12細胞未顯示出損傷作用,為增強分化PC12細胞缺氧耐受性的適合濃度。 (三)缺氧預適應小鼠腦勻漿液不同組分對NGF誘導分化的PC12細胞缺氧耐受性的影響及其可能有效成分的初步探討 1.向離體培養(yǎng)細胞中加入不同濃度的腺苷,隨著腺苷濃度增加,細胞的缺氧

14、耐受性增高,10.0μmol/L的腺苷的細胞保護作用可維持24h。急性4次重復缺氧可使小鼠腦組織腺苷含量由正常時的4.49μmol/L,上升至10.62μmol/L。缺氧預適應小鼠腦勻漿去蛋白液只在缺氧的24h內(nèi)顯著增加分化PC12細胞的缺氧耐受性,腺苷A2A受體阻斷劑可阻斷其保護作用。正常小鼠腦勻漿去蛋白液對分化PC12細胞無保護作用。因此,缺氧預適應小鼠腦勻漿液的非蛋白組分的抗缺氧作用時間較短,腺苷可能是其中一個重要的活性物質(zhì)。

15、 2.在缺氧24h和48h,缺氧預適應小鼠腦勻漿透析保留液與未經(jīng)透析的缺氧預適應小鼠腦勻漿液對分化PC12細胞均有保護作用,且經(jīng)兩種孔徑(3.5kD、7.0kD)透析袋透析的缺氧預適應小鼠腦勻漿透析保留液和未經(jīng)透析的缺氧預適應小鼠腦勻漿液對缺氧細胞的保護作用無顯著差異,說明缺氧預適應小鼠腦組織中起保護作用的主要是分子量大于7.0kD的蛋白成分。急性重復缺氧預適應小鼠腦組織中VEGF表達雖增加,但應用重組VEGF直接作用于分化的PC1

16、2細胞發(fā)現(xiàn),不同濃度的VEGF對NGF誘導分化的、不同缺氧時間的PC12細胞均無保護作用。這一結(jié)果提示:缺氧預適應小鼠腦勻漿液的蛋白組分抗缺氧作用較為持久,其中VEGF表達量雖增高,但并不參與NGF誘導分化的PC12細胞的抗缺氧作用。由于缺氧預適應小鼠腦勻漿液的蛋白組分抗缺氧作用時間持久,提示蛋白質(zhì)組學方法將是研究其中抗缺氧成分的有效方法,為今后的進一步研究提示了方向。 結(jié)論: 1.賦予重復缺氧小鼠缺氧耐受性的物質(zhì),部分

17、對機體恢復常氧供應較為敏感,部分則能持續(xù)較長時間; 2.缺氧預適應小鼠腦勻漿液對離體缺氧培養(yǎng)細胞的作用表現(xiàn)為雙相性--缺氧早期,腦勻漿液對缺氧細胞具有保護效應,延長缺氧時間,其損傷作用逐漸顯現(xiàn),這種雙相作用存在量效關系和時間效應; 3.缺氧預適應小鼠腦勻漿液可顯著提高不同來源離體培養(yǎng)細胞的缺氧耐受性,提示對缺氧細胞具有普遍的保護作用; 4.缺氧預適應小鼠腦勻漿液的蛋白組分抗缺氧作用較為持久,其中VEGF表達量雖增

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