預(yù)適應(yīng)理論抗缺氧腦損傷效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　 缺氧/缺血性腦損傷是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病、多發(fā)病，不僅影響患者肢體運(yùn)動(dòng)功能和高級(jí)認(rèn)知功能，而且具有較高致殘率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類健康和降低生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。缺氧/缺血性腦損傷的腦保護(hù)治療尤為重要，與患者預(yù)后密切相關(guān)。由于目前缺氧/缺血性腦損傷的腦保護(hù)治療方法或措施療效有限，所以腦保護(hù)治療是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)問(wèn)題。預(yù)適應(yīng)理論已經(jīng)證實(shí)具有腦保護(hù)作用，相應(yīng)機(jī)制已初步明確。缺氧/低氧/缺血預(yù)

2、適應(yīng)（Hypoxic/Ischemic Preconditioning，HPC/IPC）和藥理性預(yù)適應(yīng)（Pharmacological Preconditioning，PPC）都屬于預(yù)適應(yīng)理論范疇，如何達(dá)到預(yù)適應(yīng)理論臨床應(yīng)用即增加其臨床可操作性是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)亟待解決的問(wèn)題?；诘脱躅A(yù)適應(yīng)理論發(fā)明專利（名稱：心腦血管保健治療儀，發(fā)明人：吉訓(xùn)明等，專利號(hào)：200710176701）的問(wèn)世為預(yù)適應(yīng)理論抗缺氧/缺血性腦損傷即轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究帶來(lái)了動(dòng)力和

3、曙光。在預(yù)適應(yīng)理論抗缺氧/缺血性腦損傷效應(yīng)方面，我們既往研究發(fā)現(xiàn)，整體低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)小鼠急性腦梗死致腦缺血性損傷具有保護(hù)作用，仍存在預(yù)適應(yīng)理論臨床應(yīng)用困難；為進(jìn)一步增加臨床可操作性，我們初步證實(shí)低氧預(yù)適應(yīng)小鼠腦勻漿液提取液對(duì)大鼠鼠胚海馬神經(jīng)元缺氧復(fù)氧后神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。故在前期研究基礎(chǔ)之上，本實(shí)驗(yàn)研究將繼續(xù)探討預(yù)適應(yīng)理論抗缺氧損傷效應(yīng)，包括以下兩方面內(nèi)容：（1）低氧預(yù)適應(yīng)Wistar大鼠腦脊液、腦勻漿提取液和血漿對(duì)原代培養(yǎng)的Wista

4、r大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪損傷的作用及相關(guān)機(jī)制；（2）腺苷藥理性預(yù)適應(yīng)對(duì)原代培養(yǎng)的Wistar大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪損傷的作用及相關(guān)機(jī)制。以期通過(guò)本研究，明確預(yù)適應(yīng)理論抗缺氧腦損傷效應(yīng)，并為其轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　 研究目的
　　 1、探討低氧預(yù)適應(yīng)Wistar大鼠腦脊液、腦勻漿提取液和血漿對(duì)原代培養(yǎng)的Wistar大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪損傷的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 2、探討腺苷藥理性預(yù)適應(yīng)對(duì)原

5、代培養(yǎng)的Wistar大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪損傷的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 研究方法
　　 1、實(shí)驗(yàn)選用200-250g成年健康Wistar大鼠，雌雄不拘，進(jìn)行低氧預(yù)適應(yīng)模型復(fù)制并分別提取腦脊液、腦組織和血液，制成無(wú)菌腦脊液、腦勻漿提取液和血漿；出生24h內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠，取其海馬組織進(jìn)行神經(jīng)元原代培養(yǎng)，然后進(jìn)行氧糖剝奪培養(yǎng)。
　　 2、將培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N組）、單純氧糖剝奪組（OGD組

6、）、正常腦脊液/腦勻漿提取液/血漿干預(yù)+氧糖剝奪組（CSF/BH/BP+OGD組）和低氧預(yù)適應(yīng)腦脊液/腦勻漿提取液/血漿干預(yù)+氧糖剝奪組（HPC+OGD組），用含Na2S204（1mmol/L）的無(wú)糖Earle’s液復(fù)制神經(jīng)元氧糖剝奪損傷模型，通過(guò)比色法比較低氧預(yù)適應(yīng)和正常腦脊液、腦勻漿和血漿中SOD和MDA含量；采用AnnexinV/PI雙染及免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)狀況。
　　 3、將原代培養(yǎng)的Wista

7、r大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N組）、單純氧糖剝奪組（OGD組）、低濃度腺苷預(yù)適應(yīng)+氧糖剝奪作用（ADL+OGD組）、中濃度腺苷預(yù)適應(yīng)+氧糖剝奪作用（ADM+OGD組）和高濃度腺苷預(yù)適應(yīng)+氧糖剝奪作用（ADH+OGD組），采用AnexinV/PI雙染及免疫熒光染色法，觀察低、中、高三種腺苷濃度預(yù)處理對(duì)神經(jīng)元氧糖剝奪損傷后凋亡和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　 研究結(jié)果
　　 1、與正常大鼠腦脊液相比，低氧預(yù)適應(yīng)大

8、鼠腦脊液SOD含量升高（P<0.01），MDA含量降低（P<0.05）；與正常大鼠腦勻漿提取液相比，低氧預(yù)適應(yīng)大鼠腦勻漿提取液SOD含量明顯升高（P<0.01），MDA含量降低（P<0.01）；與正常大鼠血漿相比，低氧預(yù)適應(yīng)大鼠血漿SOD含量升高（P<0.01），MDA含量顯著降低（P<0.01）。
　　 2、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)AnnexinV/PI雙染結(jié)果顯示：N組偶有細(xì)胞凋亡，OGD組出現(xiàn)大量凋亡神經(jīng)元。正常大鼠腦脊液（P

9、<0.01）和低氧預(yù)適應(yīng)腦脊液（P<0.01）對(duì)神經(jīng)元氧糖剝奪損傷均有保護(hù)作用，后者作用更強(qiáng)（P<0.01）；正常大鼠腦勻漿提取液對(duì)損傷神經(jīng)元有微弱保護(hù)作用（P<0.05），低氧預(yù)適應(yīng)大鼠腦勻漿提取液對(duì)損傷神經(jīng)元有顯著保護(hù)作用（P<0.01）；正常大鼠血漿能保護(hù)神經(jīng)抗氧糖剝奪損傷（P<0.01），低氧預(yù)適應(yīng)大鼠血漿能更大程度上減少損傷性神經(jīng)元凋亡（P<0.01）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)與以上結(jié)果一致。
　　 3、Bcl-2蛋白和Bax蛋

10、白表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：N組僅有極少量Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)，OGD組有極少量Bcl-2蛋白表達(dá)和大量Bax蛋白表達(dá)。正常大鼠腦脊液和低氧預(yù)適應(yīng)腦脊液均能顯著增加Bcl-2蛋白表達(dá)（P<0.01），減少Bax蛋白表達(dá)（P<0.01），升高Bcl-2/Bax比率；正常大鼠腦勻漿提取液能在一定程度上增加Bcl-2蛋白表達(dá)（P<0.05），顯著減低Bax蛋白表達(dá)（P<0.01），與正常大鼠腦勻漿提取液相比，低氧預(yù)適應(yīng)大鼠腦勻漿提取液能顯著增加

11、Bcl-2蛋白表達(dá)（P<0.01），進(jìn)一步降低Bax蛋白表達(dá)（P<0.05）；正常大鼠血漿可增加Bcl-2蛋白表達(dá)（P<0.05），對(duì)Bax蛋白表達(dá)無(wú)影響（P=0.063），低氧預(yù)適應(yīng)血漿不但能更大程度上增強(qiáng)Bcl-2蛋白表達(dá)（P<0.01），還能明顯降低Bax蛋白表達(dá)（P<0.01）。
　　 4、腺苷預(yù)適應(yīng)海馬神經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與單純氧糖剝奪組相比，低劑量腺苷預(yù)處理不能產(chǎn)生神經(jīng)元氧糖剝奪損傷保護(hù)作用；中劑量腺苷預(yù)處理能減少氧糖剝奪

12、誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡數(shù)量，增加Bcl-2蛋白表達(dá)（P<0.01），減低Bax蛋白表達(dá)（P<0.01）；高劑量腺苷預(yù)適應(yīng)具有更顯著的細(xì)胞保護(hù)作用，能進(jìn)一步提高Bcl-2/Bax比率。
　　 研究結(jié)論
　　 1、低氧預(yù)適應(yīng)能誘導(dǎo)大鼠腦脊液、腦勻漿提取液和血漿SOD活性升高和MDA含量降低。
　　 2、低氧預(yù)適應(yīng)大鼠腦脊液、腦勻漿提取液和血漿能不同程度對(duì)抗神經(jīng)元氧糖剝奪損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，該作用可能是通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平，