耐受性樹突狀細(xì)胞治療小鼠炎癥性腸病的療效研究.pdf

1、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一組慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)。本病以腸道炎癥和粘膜組織損傷為特征，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前得到基本認(rèn)同的觀點(diǎn)為:環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道共生菌的參與下，啟動了腸道免疫及非免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致免疫反應(yīng)及炎癥過程。腸道粘膜免疫系統(tǒng)在

2、IBD腸道炎癥發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中始終發(fā)揮重要作用，因此調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)，恢復(fù)腸道粘膜免疫耐受成為IBD治療的關(guān)鍵。
　　樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DCs)是目前已知的功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)，是唯一能夠激活初始型T細(xì)胞的APC，研究表明DCs是一類異質(zhì)性細(xì)胞群體，具有不同的亞群和不同的功能狀態(tài)，不僅能夠遞呈抗原激活免疫細(xì)胞誘發(fā)免疫應(yīng)答，而且可以誘導(dǎo)胸腺

3、清除自身反應(yīng)性細(xì)胞、分化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞維持自身免疫耐受，因此DCs成為介導(dǎo)免疫應(yīng)答與耐受的關(guān)鍵。DCs在成熟過程中表型和功能會發(fā)生明顯變化，非成熟型或半成熟型DCs表現(xiàn)為耐受活性，這種活性隨著DCs的成熟而轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咴浴?br>　　胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)由Friend等于1994年從胸腺基質(zhì)細(xì)胞中首次分離鑒定，隨著研究的深入，TSLP在免疫應(yīng)答中的作用引起了人們的廣泛

4、關(guān)注。TSLP可直接活化DCs，微弱上調(diào)DCs表面的HLA-DR和CD86的表達(dá)，強(qiáng)烈誘導(dǎo)共刺激分子CD40和CD80的表達(dá)，并選擇性激活病理性Th2型細(xì)胞反應(yīng)，從而在過敏、炎癥及免疫疾病中扮演重要的角色。IBD作為腸道慢性炎癥性疾病，其發(fā)生發(fā)展與免疫、炎癥及過敏反應(yīng)密切相關(guān)，目前TSLP在IBD發(fā)病中的作用尚未明確，有研究表明與過敏性疾病中TSLP的致病性不同，TSLP對于腸道炎癥具有保護(hù)作用，TSLPR基因敲除小鼠建立的IBD動物模

5、型，獲得了較正常對照組更為嚴(yán)重的腸道炎癥反應(yīng)。Besin G等應(yīng)用TSLP-conditioned-DCs成功治療了小鼠的糖尿病，提示TSLP條件化的DCs具有耐受性表型，而TSLP-conditioned-DCs是否對于IBD具有治療作用目前國內(nèi)外均未見報(bào)道，為了回答此問題并深入探討TSLP在腸道免疫中的作用及機(jī)制，我們進(jìn)行如下研究。
　　材料和方法:
　　一、材料
　　2-3周齡的純系雌性NOD小鼠，SPF級，周齡

6、2～3w，體重10～12g;雌性Balb/c小鼠，SPF級，周齡8～10w，體重22～25g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，室內(nèi)溫度20±2℃，相對濕度為50％，自然光線采光，日照時(shí)間為12小時(shí)，常規(guī)飲水，普通專用飼料喂養(yǎng)。
　　二、主要試劑
　　mouse GM-CSF Peprotech公司;mouse IL-4 Peprotech公司;mouse TSLPRD公司;胎牛血清Hyclone公司;RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)

7、液Hyclone公司;FITC-CD11c熒光抗體eBioscience公司;PE-CD40熒光抗體eBioscience公司;PE-CD80熒光抗體eBioscience公司;PE-CD86熒光抗體eBioscience公司;PE-MCHII熒光抗體eBioscience公司;FITC-CD4熒光抗體eBioscience公司;PE-IFN-γ熒光抗體eBioscience公司;PE-IL-4熒光抗體eBioscience公司;PE-

8、CD25熒光抗體eBioscience公司;小鼠TNF-α ELISA試劑盒RD公司;小鼠IL-12 ELISA試劑盒RD公司;小鼠IL-10 ELISA試劑盒RD公司;脂多糖sigma公司;2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS) sigma公司;小鼠IFN-γ ELISA試劑盒RD公司;SYBR Prime Script Real-Time PCR Kit（TakaRa，DRR063s，大連寶生物工程有限公司）;目的基因和內(nèi)參引物DNA

9、（TakaRa Custom DNA，由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)）;小鼠IL-1β ELISA試劑盒RD公司;小鼠IL-4 ELISA試劑盒RD公司;小鼠IL-17 ELISA試劑盒RD公司。
　　三、主要儀器和設(shè)備
　　倒置顯微鏡;低溫高速離心機(jī)(Eppendof);超低溫冰箱;超凈工作臺;流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，BD Bioscience);全自動ELISA分析儀(BioTek，ELx808);Lig

10、ht Cycler Real Time PCR擴(kuò)增儀(Roche)
　　四、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬┬∈蠊撬柙葱詷渫粻罴?xì)胞的體外培養(yǎng)及表型鑒定
　　采集NOD小鼠骨髓細(xì)胞，于體外應(yīng)用GM-CSF誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)細(xì)胞分為三組，一組不加干預(yù)，另兩組于第六日分別給予TSLP及LPS刺激，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型，并收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測IL-10、IL-12、TNF-α的表達(dá)。
　?。ǘ?yīng)用TN

11、BS建立小鼠炎癥性腸病模型
　　分別應(yīng)用100mg/kgTNBS+無水乙醇、150mg/kgTNBS+50％乙醇及100mg/kgTNBS+25％乙醇溶液灌腸，建立Balb/c小鼠炎癥性腸病動物模型。造模后觀察小鼠一般狀態(tài)，DAI評分，大體形態(tài)損傷評分，病理組織學(xué)評分，了解不同配比灌腸液誘導(dǎo)IBD動物模型的效果及疾病嚴(yán)重程度的變化趨勢，收集腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞及脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，三日后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液應(yīng)用ELISA法檢測細(xì)胞

12、因子IL-4和IFN-γ的表達(dá)，收集細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測腸系膜淋巴結(jié)及脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+IFN-γ+及CD4+IL-4+雙陽性T細(xì)胞的表達(dá)率。
　?。ㄈ└深A(yù)實(shí)驗(yàn)
　　分別應(yīng)用PBS、TSLP-DCs、TSLP-腹腔注射、TSLP灌腸、imDCs于IBD小鼠模型建立后3小時(shí)進(jìn)行干預(yù)治療，并連續(xù)三日給藥，每日觀察小鼠生存率、一般狀態(tài)、DAI評分，三日后處死小鼠，評估大體損傷程度，取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織進(jìn)行H-E染色觀察病理改變進(jìn)

13、行病理組織評分;取中段結(jié)腸組織均漿后應(yīng)用ELISA法檢測IL-17、IL-1β、IL-23、IL-4的表達(dá);取近端結(jié)腸組織應(yīng)用real-time PCR法檢測IL-4、IL-17、IL-23、IL-1β、INF-γ、IL-10、IL-6、Foxp3的表達(dá);收集腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，培養(yǎng)三日后收集細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T（regulatory t cell Tregs）細(xì)胞的表達(dá)率。
　?。ㄋ模┙y(tǒng)計(jì)分析
　

14、　所有數(shù)據(jù)采用Mean±SD來表示，差異比較采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)及方差分析，p＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、應(yīng)用GM-CSF于體外可誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞。
　　2、TSLP處理的DCs表現(xiàn)為半成熟DCs表型，其細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌較高濃度抑制性細(xì)胞因子IL-10，而炎癥性細(xì)胞因子TNF-α及IL-12的濃度明顯降低。
　　3、應(yīng)用TNBS+乙醇一

15、次性灌腸可建立IBD動物模型，100mg/kg TNBS+無水乙醇一次性灌腸建立的小鼠模型腸道炎癥明顯，而且小鼠存活率高，造模后第三日疾病嚴(yán)重程度最明顯。
　　4、應(yīng)用100mg/kgTNBS+無水乙醇建立的IBD小鼠模型，結(jié)腸炎癥以Th1型細(xì)胞反應(yīng)為主，結(jié)合其大體損傷及病理改變提示該方案建立的動物模型與人類的Crohn病相似。
　　5、TSLP-DCs干預(yù)治療明顯提高了IBD小鼠的存活率，小鼠一般狀態(tài)、DAI評分、大體損傷

16、評分及病理組織評分明顯好于對照組，TSLP-腹腔注射組加重了小鼠結(jié)腸炎癥改變，TSLP灌腸及imDCs治療組改善了IBD小鼠的結(jié)腸炎癥，但其疾病評分及病理組織評分不優(yōu)于TSLP-DCs治療組。
　　6、TSLP-DCs干預(yù)治療促進(jìn)小鼠結(jié)腸組織Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-10）的產(chǎn)生，而明顯抑制了Th1型（IL-1β、IL-6、INF-γ）及TH17型（IL-17、IL-23）細(xì)胞因子的產(chǎn)生;TSLP-DCs干預(yù)治療組小鼠腸系

17、膜淋巴結(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)率明顯增高，且調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)明顯增高。提示TSLP-DCs干預(yù)治療改善了IBD小鼠的結(jié)腸炎癥可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2及Th17/Tregs的平衡而獲得。
　　7、與TSLP-腹腔注射組加重小鼠腸道炎癥反應(yīng)不同，TSLP灌腸組改善了IBD小鼠的結(jié)腸炎癥，提示TSLP于不同的組織器官作用不同，其機(jī)制可能與組織微環(huán)境及DCs的亞群相關(guān)，由此可見進(jìn)一步研究腸道DCs的功能特征成為進(jìn)一