副流感病毒5型CC-14株作為狂犬病重組疫苗載體的基礎(chǔ)研究.pdf

1、狂犬病是全球流行、危害嚴(yán)重的人獸共患病，由嗜神經(jīng)性的狂犬病病毒（rabies virus, RABV）感染所引起。自2007年以來(lái)，我國(guó)人狂犬病疫情持續(xù)下降，但每年仍有1000例左右，且流行區(qū)域有不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)，這對(duì)于動(dòng)物免疫覆蓋率不高的我國(guó)大部分地區(qū)而言，形勢(shì)仍然相當(dāng)嚴(yán)峻。
　　人在狂犬病的傳播中居于最后一個(gè)環(huán)節(jié)，幾乎所有人的狂犬病都是從動(dòng)物傳播而來(lái)。因此，人狂犬病的根本控制需要從源頭入手，即控制流浪犬和野生動(dòng)物狂犬病的傳播。流

2、浪動(dòng)物和野生動(dòng)物狂犬病唯一可行的控制方式是口服免疫?？诜呙缬袃深?，分別為減毒活疫苗和重組活載體疫苗，其中減毒活疫苗主要在歐洲使用，因存在一定的殘存毒力，不適用于流浪犬或與人群接觸較多的野生動(dòng)物。目前，美國(guó)、加拿大和歐洲分別批準(zhǔn)了以痘苗病毒和人5型腺病毒為載體表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組疫苗在不同野生動(dòng)物種群中的應(yīng)用或試驗(yàn)研究，有效降低了動(dòng)物狂犬病的發(fā)病率，取得了良好的免疫效果。但我國(guó)尚無(wú)類似疫苗上市，而從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展來(lái)看，口服疫苗的研制和應(yīng)

3、用才是我國(guó)流浪犬和野生動(dòng)物狂犬病控制的必經(jīng)之路。
　　副流感病毒5型（Parainfluenza virus5, PIV5）系副黏病毒科（Paramyxov iridae），腮腺炎病毒屬（Rubulavirus），其基因組為單股負(fù)鏈RNA，該病毒于1956年自猴體內(nèi)首次分離，故以往稱之為猴病毒5型（Simian virus5, SV5）。臨床上，該病毒可引起犬病發(fā)“犬窩咳”，除此之外，本實(shí)驗(yàn)室于2013年在長(zhǎng)春白城地區(qū)肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)

4、現(xiàn)該地區(qū)犢牛亦可感染該病毒（分離毒株為PV5-BC14株）而暴發(fā)呼吸道疾病。隨著負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PIV5因其感染方式直接、宿主范圍廣泛、基因組相對(duì)穩(wěn)定、在大多數(shù)細(xì)胞中可獲得高滴度的病毒等諸多優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，先后成為流感病毒、RABV等重要病原的重組疫苗載體，具有廣闊的應(yīng)用空間和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　本研究嘗試以PIV5犬源疫苗株（CC-14株）為載體，建立其反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，使之表達(dá)具有良好免疫原性的RAB

5、V BD06株糖蛋白，旨在研制一種免疫效果較好的新型狂犬病重組口服疫苗。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，PIV5牛源PV5-BC14株與犬源CC-14株同源性最高（基于NP基因編碼區(qū)序列）。而且近年來(lái)，牛感染狂犬病的情況在新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江等地常有發(fā)生，且多由狐貍、流浪犬咬傷引起。因此，以PIV5犬源疫苗株CC-14株作為載體的狂犬病重組疫苗的研究對(duì)于犬和?？袢〉念A(yù)防都有實(shí)際意義。
　　本研究的試驗(yàn)過(guò)程及相應(yīng)結(jié)果概述如下：
　　1.

6、PIV5 CC-14株全基因組測(cè)序及分析：根據(jù)GenBank中報(bào)道的SV5株全基因組序列設(shè)計(jì)14對(duì)引物，通過(guò)RT-PCR方法獲得了覆蓋全長(zhǎng)的14個(gè)基因片段，并將這些片段分別克隆進(jìn)pMD18-T載體中，以通用引物進(jìn)行序列測(cè)定、拼接并分析。結(jié)果顯示，PIV5 CC-14株的全基因組大小為15246nt(基因庫(kù)登錄號(hào)為KP893891)，其與大多數(shù)PIV5毒株基因組結(jié)構(gòu)的不同之處在于CC-14株沒(méi)有SH基因。以高度保守的1530bp NP基因

7、序列對(duì)現(xiàn)有PIV5毒株進(jìn)行同源比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生分析，同源比對(duì)結(jié)果表明，PIV5 CC-14株與其他17株參考序列的核苷酸同源性為97.25％～99.80%，推導(dǎo)氨基酸同源性為98.62%～99.80%；系統(tǒng)發(fā)生分析表明，CC-14株和牛源PV5-BC14株同屬一個(gè)分支。
　　2. PIV5 CC-14株感染性克隆的構(gòu)建：對(duì)PIV5 CC-14基因組全長(zhǎng)進(jìn)行酶切圖譜分析，根據(jù)酶切位點(diǎn)的分布，設(shè)計(jì)7對(duì)引物，分段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到目

8、的基因片段，經(jīng)過(guò)一系列酶切、連接、亞克隆、克隆等過(guò)程，構(gòu)建出基因組全長(zhǎng)cDNA：pPIV5，該質(zhì)粒中預(yù)設(shè)了外源基因的插入位點(diǎn)NotⅠ。為驗(yàn)證該反向遺傳系統(tǒng)的完善性，將兩端含有PIV5轉(zhuǎn)錄復(fù)制元件的EGFP編碼區(qū)基因按照上述常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法插入pPIV5的NotⅠ位點(diǎn)，從而構(gòu)建出pPIV5-EGFP；基于RABV強(qiáng)度株BD06的糖蛋白具有較好的免疫原性，將兩端含有PIV5轉(zhuǎn)錄復(fù)制元件的B D06糖蛋白（glycoprotein, G）編碼區(qū)基

9、因插入pPIV5的NotⅠ位點(diǎn)，從而構(gòu)建出pPIV5-BD06-G。為提高病毒的拯救效率，在構(gòu)建基因組全長(zhǎng)cDNA時(shí)，在基因組cDNA上游引入T7啟動(dòng)子，使基因組全長(zhǎng)cDNA置于T7啟動(dòng)子下游，另外，在基因組cDNA下游引入丁肝病毒核酶結(jié)構(gòu)（HdvRz）。此外，按照上述常規(guī)試驗(yàn)方法分別構(gòu)建三個(gè)輔助質(zhì)粒pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L。上述試驗(yàn)所得質(zhì)粒分別經(jīng)酶切鑒定、序列測(cè)定、拼接和分析，最終確定所有質(zhì)粒

10、序列準(zhǔn)確無(wú)誤。
　　3. PIV5 CC-14株重組病毒的拯救：將驗(yàn)證質(zhì)粒pPIV5-EGFP，輔助質(zhì)粒pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于6孔板中的BHK-T7細(xì)胞，待轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞瓶中培養(yǎng)3-4天，觀察是否有熒光，目前本實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。
　　4.重組病毒拯救輔助細(xì)胞系的構(gòu)建（穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的MDCK細(xì)胞系的構(gòu)建）：鑒于PIV5 CC-14株在MDCK細(xì)

11、胞生長(zhǎng)良好，因此我們嘗試采用MDCK細(xì)胞來(lái)構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的MDCK細(xì)胞系，用于將感染性克隆包裝成病毒。首先，通過(guò)G418篩選確定MDCK細(xì)胞的G418最低致死濃度為1300μg/ml；其次，將表達(dá)T7 RNA聚合酶的質(zhì)粒pcDNA3.1-T7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常MDCK細(xì)胞，次日施加1300μg/ml的G418壓力，此后，每隔兩天更換一次1300μg/ml的G418培養(yǎng)基，兩周后將生長(zhǎng)出來(lái)的細(xì)胞采用有限稀釋挑取單克??；最后，

12、將挑取的單克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗(yàn)證質(zhì)粒pUC57-IRES-T7-EGFP以及其他方法驗(yàn)證是否獲得該細(xì)胞系，此實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。
　　5. PIV5 CC-14株檢測(cè)方法的建立：由于該病毒沒(méi)有細(xì)胞病變（CPE），我們分別用RT-PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)、血細(xì)胞吸附、血凝試驗(yàn)這四種方法來(lái)檢測(cè)該病毒，研究表明，這些方法中血細(xì)胞吸附是一種非常便捷的方法。
　　總結(jié)：
　　1.本研究完成了PIV5 CC-14株全基因組測(cè)序(登錄號(hào)：KP

13、893891)及分析。
　　2.構(gòu)建了 pcDNA3.1-NP, P, L三個(gè)輔助質(zhì)粒以及 pPIV5, pPIV5-EGFP, pPIV5-BD06-G三個(gè)全長(zhǎng)質(zhì)粒。
　　3.建立了便捷的血細(xì)胞吸附的方法檢測(cè)PIV5 CC-14株。
　　4.穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的MDCK細(xì)胞系的構(gòu)建以及重組病毒的拯救實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。
　　論文的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.本課題是國(guó)內(nèi)首次嘗試將PIV5病毒載體用于狂犬病重組疫