重配H1N1亞型流感病毒減毒疫苗株的研究.pdf

1、流感是由流感病毒(influenza virus)引起的一種以侵害呼吸系統(tǒng)為主的疾病，在世界各國廣泛流行，是危害人類健康的重要傳染病之一，因此，WHO宣布對流感要嚴(yán)加監(jiān)控。20世紀(jì)曾有過3次全球性的流感大流行，僅第一次大流行(1918～1919年)就造成2000多萬人死亡，比第一次世界大戰(zhàn)死亡的總?cè)藬?shù)還要多，而且死亡的大多數(shù)是青壯年，造成巨大的社會和經(jīng)濟損失。據(jù)國家權(quán)威部門透露，我國每年流感的發(fā)病高達10億人次以上，經(jīng)濟損失數(shù)百億元以上

2、。近些年來，我國的生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重破壞，人流感的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律發(fā)生了較大變化，發(fā)病頻率上升，造成了嚴(yán)重的社會影響和重大的經(jīng)濟損失。 流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)：是一種含有8個不同基因片段的分節(jié)段RNA病毒，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中A型流感病毒對人類危害最嚴(yán)重，它引起的并發(fā)癥危害大，造成神經(jīng)．內(nèi)分泌．免疫網(wǎng)絡(luò)的紊亂，已嚴(yán)重影響人類健康和國家經(jīng)濟建設(shè)。A型人流感病毒自發(fā)現(xiàn)以來，曾出現(xiàn)過三

3、種亞型：1918～1919年西班牙流感流行的是H1N1亞型；1957年之前H2N2亞型出現(xiàn)，而H1N1亞型消失了：1968年H3N2亞型出現(xiàn)，而H2N2至今沒有出現(xiàn)；1977年H1N1再次出現(xiàn)，而至今H1N1亞型仍是流行主型，它引起的流感大流行對人類社會的嚴(yán)重危害性和公共衛(wèi)生意義都受到關(guān)注。編碼流感病毒的抗原主要有血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)、核蛋白(Nuclear Pr

4、otein，NP)和基質(zhì)蛋白M(Matrix2)等多肽分子。由于HA、NA高度變異決定著病原體的特殊性，致使每年都有新的病毒株出現(xiàn)，給流感的防控帶來了難題。 目前，對于流感尚無有效的治療手段，而疫苗免疫接種發(fā)揮著重要的作用。流感疫苗經(jīng)過五十多年的發(fā)展，主要有滅活全病毒疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗和減毒活疫苗。由于流感病毒的抗原變異性大，使得疫苗生產(chǎn)每年都需要更換病毒株。當(dāng)前使用的注射三價滅活疫苗有效，但在保護效果，特別

5、是交叉免疫保護和接種策略上還不理想；亞單位疫苗使用安全，主要針對HA、NA抗原，有一定的免疫保護效果，但是制備周期長，對于季節(jié)性流感來說不太實用，并且保護譜不全面；DNA疫苗起步較晚，主要針對某一保護性抗原成分設(shè)計，仍然是保護不全面，另外 抗原用量大、特別是潛在基因整合等瓶頸問題；而傳統(tǒng)的減毒活疫苗可以誘導(dǎo)包括細胞免疫、體液免疫和局部免疫在內(nèi)的較全面的免疫效應(yīng)，但仍保留一定殘余毒力，存在潛在的“返祖”現(xiàn)象，因此迫切需要發(fā)展新的疫

6、苗研制手段。近年來，反向遺傳技術(shù)的誕生為減毒活疫苗的發(fā)展提供了良好的契機。目前，基于RG(reverse genetics，RG)技術(shù)的流感減毒活疫苗成為流感疫苗發(fā)展的方向，1999年Neumann等、Hoffmann等學(xué)者建立了完全以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的流感病毒反向遺傳技術(shù)，為流感減毒活疫苗的研制提供了新的思路。以冷適應(yīng)減毒病毒株為背景，拯救重配的流感減毒活疫苗株，進而研發(fā)新一代的流感減毒活疫苗是當(dāng)今流感疫苗研究的熱點。本研究采用反向遺傳技術(shù)

7、，通過8質(zhì)粒流感病毒拯救系統(tǒng)，以冷適應(yīng)流感病毒株A/Ann Arbor/6/60(H2N2)的6個內(nèi)部基因為病毒骨架，與2006～2007年流感病毒株A/New Caledonia/20/99(H1N1)的HA和NA基因重排，建立了重配冷適應(yīng)H1N1亞型流感病毒株拯救體系，為流感減毒活疫苗的研發(fā)開辟了新的思路，同時為流感的安全、有效免疫預(yù)防提供研制策略和理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容包括：一、雙向轉(zhuǎn)錄/表達載體pAD3000的構(gòu)建 要想

8、得到拯救成功的重配流感病毒株，必須要有一套完善的拯救體系，而在拯救體系中，表達載體起著至關(guān)重要的作用。為了使得轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在拯救系統(tǒng)中能夠高表達，提高其在細胞中的轉(zhuǎn)錄翻譯水平，我們對載體pHW2000進行了改造，根據(jù)轉(zhuǎn)染所用細胞的類型，選擇用SV40的多聚A(polyA)信號序列取代牛生長激素(BGH)的多聚腺苷酸信號序列，以期獲得高效的轉(zhuǎn)染效率和病毒拯救效率，為流感減毒活疫苗的制備提供理論基礎(chǔ)。根據(jù)相關(guān)文獻報道，利用pcDNA3.1(+)

9、質(zhì)粒為模板，擴增得到了SV40的多聚A(polyA)信號序列，該片段大小為138bp。同時從國外得到的雙向轉(zhuǎn)錄/表達載體pHW2000，是在pcDNA3.0的基礎(chǔ)上經(jīng)過一系列的改造而演化而來的，在該載體的基礎(chǔ)上，我們將其升級為雙向轉(zhuǎn)錄/表達載體pAD3000，通過PCR擴增和測序驗證基因序列是完全正確的，并且利用序列分析軟件對其全序列進行了分析。以上工作為流感病毒8質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄/表達載體的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。 二、流感病毒8質(zhì)粒系統(tǒng)

10、的構(gòu)建 利用構(gòu)建好的雙向轉(zhuǎn)錄/表達載體pAD3000載體系統(tǒng)，選擇冷適應(yīng)、減毒的流感病毒株A/Ann Arbor/6/60的6個內(nèi)部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)作為拯救病毒骨架，人工合成其基因全序列，同時引入PB1-391E，581G，661T，PB2-265S，NP-34G5個氨基酸的突變位點，根據(jù)己發(fā)表的序列設(shè)計擴增6個基因的特異引物對。 將2006～2007年WHO宣布的H1N1亞型流感病毒疫苗株A

11、/New Caledonia/20/99，接種10～11日齡SPF雞胚增殖，通過蔗糖密度梯度離心純化病毒，提取基因組總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Hoffmann等發(fā)表的通用引物序列擴增HA和NA基因并測序。為獲得準(zhǔn)確的5'和3'端序列，在PCR過程中采用高保真聚合酶，且挑選8～10個克隆測序，保證序列的準(zhǔn)確性。經(jīng)序列分析軟件比對，得到拼接出含5'和3'端非編碼區(qū)的8個基因的全長序列。設(shè)計帶有BsmBⅠ、BsaⅠ或AarⅠ酶切位點的引

12、物擴增A/Ann Arbor/6/60的6個內(nèi)部基因片段和A/New Caledonia/20/99的HA和NA基因，分別克隆入pAD3000，并進行了測序驗證，從而構(gòu)建了8個pol Ⅰ-polⅡ系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄傣達質(zhì)粒，分別命名為pMDV-A-PB2，pMDV-A-PB1，pMDV-A-PA，pMDV-A-NP，pMDV-A-M，pMDV-A-NS，pMDV-A-HA，pMDV-A-NA，以期通過同一個載體、轉(zhuǎn)染后利用細胞中的pol Ⅰ和p

13、olⅡRNA聚合酶、實現(xiàn)vRNA和mRNA的轉(zhuǎn)錄和表達，為冷適應(yīng)H1N1亞型流感病毒減毒株的構(gòu)建提供了保證。 三、重配H1N1亞型流感病毒減毒株的制備 1、冷適應(yīng)流感病毒拯救系統(tǒng)的驗證 用A/New Caledonia/20/99的2個表面基因(HA和NA)或冷適應(yīng)病毒株A/Ann．Arbor/6/60的任意一個內(nèi)部基因，而其它內(nèi)部基因來自A/PR/8/34，進行所有組合的基因重排，即8種7+1和1種6+2組合形

14、式，將相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄/表達質(zhì)粒組合，共轉(zhuǎn)染COS-1細胞，均產(chǎn)生了預(yù)期組合、有感染性的H1N1亞型流感病毒，表明構(gòu)建的8個轉(zhuǎn)錄/表達載體均能有效工作，且冷適應(yīng)病毒株的6個內(nèi)部病毒骨架能夠協(xié)同發(fā)揮作用，為進一步篩選和構(gòu)建重配冷適應(yīng)流感病毒株奠定了基礎(chǔ)。同時用整合A/PR/8/34的8個基因的重組質(zhì)粒作陽性對照，也產(chǎn)生了轉(zhuǎn)染子病毒。在這個過程中，優(yōu)化共轉(zhuǎn)染體系，在35mmdish上即可產(chǎn)生足以直接用雞胚增殖的子代病毒。 對7+1組合的P

15、B2/PR8、PR8轉(zhuǎn)染子代病毒及6+2組合的PR8/rMDV-A進行了初步鑒定和部分生物學(xué)特性分析。經(jīng)電鏡觀察，轉(zhuǎn)染子病毒的形態(tài)與野生型流感病毒相似。RT-PCR表明引入的氨基酸突變在子代病毒中存在。HA、HI和IFA(indirectimmunofluorecent assay，IFA)顯示有重配病毒產(chǎn)生。PR8/rMDV-A的PFU結(jié)果表明低溫如33℃更利于重配病毒的繁殖，經(jīng)過雞胚傳代和MDCK感染實驗，PR8/rMDV-A病毒

16、能在雞胚中高滴度增殖，感染雞胚的能力強，這與提供表面基因的MPR/8/34病毒株相似，而且對雞胚的毒力弱、低溫利于病毒增殖這又與提供6個內(nèi)部基因的A/AnnArbor/6/60相似。以上這些實驗結(jié)果證實了冷適應(yīng)病毒拯救系統(tǒng)的有效性。 2、H1N1流感病毒減毒疫苗株的拯救及鑒定 利用驗證好的冷適應(yīng)的流感病毒6個質(zhì)粒系統(tǒng)，作為拯救流感病毒的骨架，與構(gòu)建好的2006～2007年流感病毒株A/New Caledonia/20/9

17、9(H1N1)的HA和NA基因進行重排，8個重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-1細胞，成功得到了重配H1N1亞型流感減毒病毒株，拯救的流感減毒株在第一代雞胚尿囊液中病毒效價為1：512～1：1024，連續(xù)傳4代之后，發(fā)現(xiàn)病毒效價穩(wěn)定，各代之間HA和NA基因的同源性達99.9％以上，經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)重配病毒的形態(tài)與野生流感病毒株沒有明顯差別，并對其生物學(xué)特性進行了初步的鑒定，深入的研究工作還在進行之中。以上建立的反向遺傳系統(tǒng)重配冷適應(yīng)H1N1亞型流感病