TSHR基因敲除對(duì)小鼠肝臟糖異生影響的研究.pdf

1、研究背景:
　　亞臨床甲狀腺功能減退癥(SCH)是指血清促甲狀腺激素(TSH)水平升高，但血清游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)水平正常，患者無(wú)明顯臨床癥狀的一種甲狀腺疾病。隨著人們對(duì)亞臨床甲減的關(guān)注和高靈敏度TSH檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，亞臨床甲減的患病率呈升高趨勢(shì)。有文獻(xiàn)報(bào)道稱總體人群中亞臨床甲減的患病率為4％-10％。近年來(lái)有關(guān)亞臨床甲減的臨床研究發(fā)現(xiàn)，SCH患者常出現(xiàn)空腹胰島素水平升高或胰島素抵抗，服用

2、左旋甲狀腺素進(jìn)行替代治療使其血清TSH水平降至正常范圍后，SCH患者的胰島素敏感性有所改善，空腹血糖水平有所下降。目前有關(guān)此現(xiàn)象的研究較少。有研究結(jié)果提示血清甲狀腺激素(TH)水平的變化與胰島素敏感指數(shù)呈正相關(guān)。然而，有臨床研究發(fā)現(xiàn)，即使通過(guò)相同程度的體育鍛煉或減肥后，亞甲減患者胰島素敏感性的改善程度低于甲狀腺功能正常者;正常范圍內(nèi)的血清TSH水平與空腹胰島素水平呈正相關(guān)。此外，有關(guān)TSHR基因多態(tài)性相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TSHR基因Asp72

3、7Glu位點(diǎn)的多態(tài)性與胰島素抵抗有關(guān)。以上這些臨床研究結(jié)果提示促甲狀腺激素可能在機(jī)體糖代謝中發(fā)揮作用。
　　TSH是一種由腺垂體合成并分泌的激素，在體內(nèi)直接參與甲狀腺生理功能的調(diào)節(jié)。TSH與甲狀腺細(xì)胞膜表面的TSH受體(TSHR)結(jié)合后，經(jīng)G蛋白介導(dǎo)，通過(guò)cAMP途徑或二磷酸肌醇途徑來(lái)調(diào)節(jié)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。TSHR是介導(dǎo)TSH發(fā)揮其甲狀腺調(diào)控功能重要的蛋白分子。TSHR主要表達(dá)于甲狀腺細(xì)胞，但多種甲狀腺外組織器

4、官上亦有表達(dá)。我們以前的研究證實(shí)，肝臟組織表達(dá)有功能活性的TSHR，TSH與肝細(xì)胞膜上TSHR結(jié)合后，上調(diào)膽固醇合成的限速酶——3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)表達(dá)。
　　肝臟是調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要器官。在空腹?fàn)顟B(tài)下，肝臟通過(guò)增強(qiáng)糖異生和肝糖原分解來(lái)維持空腹血糖的穩(wěn)定。肝臟是糖異生的主要器官，體內(nèi)約90％的糖異生在肝臟進(jìn)行，肝臟糖異生受多種激素的調(diào)節(jié)，如胰島素、胰高血糖素和糖皮質(zhì)激素等。其中胰高血糖素、糖皮質(zhì)激素對(duì)空

5、腹血糖的調(diào)節(jié)，主要通過(guò)cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路上調(diào)糖異生的關(guān)鍵酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)及葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)的表達(dá)，從而增強(qiáng)糖異生，增加肝糖輸出，升高血糖。可見，cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路在升糖激素調(diào)節(jié)空腹血糖水平中扮演重要角色，該信號(hào)通路的調(diào)節(jié)異常對(duì)肝臟糖代謝有非常重要的影響。
　　cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）是細(xì)胞核內(nèi)的重要調(diào)控因子，在機(jī)體能量物質(zhì)代謝中有重要作用，其對(duì)轉(zhuǎn)錄的

6、調(diào)節(jié)主要是通過(guò)其自身磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在肝臟糖代謝方面，CREB參與維持空腹血糖的穩(wěn)定。研究認(rèn)為，CREB是啟動(dòng)糖異生的關(guān)鍵調(diào)控因子，在糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G6P基因的啟動(dòng)子區(qū)域，有CREB的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)CREB與CREB結(jié)合蛋白(CBP)結(jié)合后，能夠促進(jìn)PEPCK、G6P基因的轉(zhuǎn)錄，從而啟動(dòng)糖異生。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，TSH可以量效性及時(shí)效性的增加L02細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，進(jìn)而激活蛋白激酶A(PKA)，增加CREB的磷酸化水平，從而

7、促進(jìn)肝臟膽固醇合成;提示TSH作為上游分子參與了cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，從而影響肝臟脂代謝。由此，我們認(rèn)為有對(duì)TSH是否影響糖代謝進(jìn)行研究的可能。
　　腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是調(diào)節(jié)能量代謝的重要因子之一，在肝臟的糖代謝中發(fā)揮尤為重要的作用。臨床常用的降糖藥物二甲雙胍通過(guò)激活肝臟和骨骼肌的AMPK，抑制肝臟糖異生，促進(jìn)骨骼肌葡萄糖的攝取，增加胰島素敏感性，發(fā)揮降低血糖的作用。AMPK對(duì)糖異生的抑制性調(diào)節(jié)主要

8、通過(guò)下調(diào)糖異生關(guān)鍵酶的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。肝臟作為胰島素作用的三大靶器官之一，在全身性胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。研究證實(shí)，AMPK是胰島素敏感性正向調(diào)節(jié)因子，AMPK基因敲除可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生胰島素抵抗。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，TSH可以抑制甲狀腺細(xì)胞的AMPK活性。因此，以上研究進(jìn)一步在理論上支持我們對(duì)TSH在肝臟糖代謝中的影響進(jìn)行研究。
　　基于以上的研究發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)TSH可能參與肝臟糖代謝。本研究擬通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究TSH對(duì)肝臟

9、糖代謝可能存在的影響。
　　研究目的:
　　1.繁殖飼養(yǎng)TSHR基因敲除小鼠，觀察TSHR基因敲除對(duì)小鼠空腹血糖及胰島素水平的影響，分析TSHR基因的體內(nèi)失活對(duì)肝糖原含量、肝臟糖異生可能存在的影響。
　　2.在體外實(shí)驗(yàn)中觀察TSH對(duì)肝臟糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)的影響。
　　研究方法:
　　1.TSHR基因敲除小鼠的繁殖飼養(yǎng):采用TSHR基因敲除雜合型小鼠交配得到實(shí)驗(yàn)所需的野生型小鼠及純合型小鼠，普通PCR法鑒定小鼠

10、基因型。小鼠的飼養(yǎng)繁殖均在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境中進(jìn)行。
　　2.小鼠一般發(fā)育指標(biāo)及糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定:實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)量小鼠體長(zhǎng)、稱量體重、計(jì)算臟器指數(shù)（肝臟重量/體重、心臟重量/體重、腎臟重量/體重），測(cè)定小鼠血清總膽固醇、甘油三酯、高/低密度脂蛋白水平，測(cè)定小鼠血清總T4、TSH、胰島素、胰高血糖素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1及空腹血糖水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)。
　　3.耐量試驗(yàn):小鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)、胰島素耐量試驗(yàn)

11、及丙酮酸耐量試驗(yàn)，觀察TSHR基因敲除對(duì)小鼠整體糖代謝水平的影響。
　　4.TSHR基因敲除對(duì)小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)及肝糖原分布的影響:小鼠肝臟組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞的組織學(xué)特征;小鼠肝臟組織切片進(jìn)行糖原染色（PAS染色），觀察肝細(xì)胞內(nèi)糖原顆粒的分布情況。
　　5.TSHR基因敲除對(duì)小鼠肝糖原含量的影響:采用蒽酮比色法，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;提取小鼠肝臟組

12、織糖原，測(cè)定吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)小鼠肝糖原含量進(jìn)行定量。
　　6.TSHR基因敲除對(duì)小鼠肝臟糖異生關(guān)鍵酶G6P、PEPCK及葡萄糖激酶(GK)基因表達(dá)的影響:采用Real-timePCR法檢測(cè)TSHR基因敲除小鼠肝臟組織中G6P、PEPCK、GK的基因表達(dá)水平，觀察TSHR基因敲除對(duì)肝臟糖異生能力的影響。
　　7.TSHR基因敲除對(duì)小鼠肝臟CREB、AMPK、GSK3β磷酸化蛋白水平的影響:采用WesternBlot法

13、檢測(cè)肝臟總CREB、AMPK、GSK3β蛋白表達(dá)水平及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平，觀察TSHR基因敲除對(duì)小鼠肝臟CREB、AMPK、GSK3β蛋白表達(dá)水平及其磷酸化水平的影響。
　　8.TSH刺激對(duì)HepG2細(xì)胞糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)的影響:0.2μmTSH刺激培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，測(cè)定HepG2細(xì)胞糖異生關(guān)鍵酶G6P、PEPCK基因表達(dá)水平，在體外觀察TSH對(duì)肝臟糖異生的影響。
　　結(jié)果:
　　1.TSHR基因敲除對(duì)小鼠一般發(fā)育

14、指標(biāo)及糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響:8周齡TSHR基因敲除小鼠的體重明顯低于同周齡野生型小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但各臟器指數(shù)（心臟、肝臟、腎臟）均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);TSHR基因敲除小鼠的體長(zhǎng)較野生型小鼠偏小，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TSHR基因敲除小鼠從3周齡斷乳時(shí)開始飼喂含100ppm甲狀腺素的飼料。6周齡及8周齡TSHR基因敲除小鼠的血清總T4水平與同周齡野生型小鼠相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.

15、372和P=0.481）。同時(shí)，8周齡TSHR基因敲除小鼠的血清TSH水平與同周齡野生型小鼠相比，亦無(wú)顯著性差異(P＞0.05，P=0.759)。與野生型小鼠比較，TSHR基因敲除小鼠的血清總膽固醇及高密度脂蛋白水平均明顯降低(P＜0.05);但TSHR基因敲除小鼠的血清低密度脂蛋白水平僅有下降趨勢(shì)，血清甘油三酯水平有上升趨勢(shì)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。8周齡TSHR基因敲除小鼠的空腹血糖水平明顯低于同周齡野生型小鼠(P＜0.

16、001)，胰島素敏感指數(shù)較野生型小鼠增加(P=0.001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但其空腹胰島素水平與野生型小鼠相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。同時(shí)，TSHR基因敲除小鼠的血清胰高血糖素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)水平與野生型小鼠相比亦均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　2.肝組織HE染色特征:TSHR基因敲除小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)與野生型小鼠相比，無(wú)明顯變化;光鏡下可見排列整齊的肝細(xì)胞，呈多邊形，中央有大而圓的核，胞質(zhì)均勻，在匯

17、管區(qū)周圍呈放射狀分布，未見炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。
　　3.耐量試驗(yàn):
　　口服葡萄糖耐量試驗(yàn):兩組小鼠分別給予2g/kg葡萄糖灌胃，TSHR基因敲除小鼠各時(shí)間點(diǎn)(0min、30min、60min、120min)血糖水平較野生型小鼠各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)血糖水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　胰島素耐量試驗(yàn):兩組小鼠分別給予腹腔注射1.0U/kg胰島素，TSHR基因敲除小鼠各時(shí)間點(diǎn)(0min、15min、30min、60m

18、in、90min)血糖水平較野生型小鼠各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)血糖水平有降低的趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　丙酮酸耐量試驗(yàn):兩組小鼠分別給予腹腔注射2g/kg丙酮酸鈉后，TSHR基因敲除小鼠各時(shí)間點(diǎn)(30min、60min、90min)血糖水平較野生型小鼠各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)血糖水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.糖原含量:8周齡TSHR基因敲除小鼠的肝糖原含量明顯高于同周齡野生型小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

19、P＜0.05，P=0.039)，與肝糖原染色觀察到的結(jié)果一致。
　　5.TSHR基因敲除小鼠肝組織PEPCK、G6P、GKmRNA表達(dá):TSHR基因敲除小鼠的肝臟組織PEPCK、G6PmRNA表達(dá)水平均低于野生型小鼠，分別降低了36％和47％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);TSHR基因敲除小鼠肝臟GKmRNA表達(dá)水平與野生型小鼠相比升高了1.38倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P=0.025)。
　　6.TSHR基

20、因敲除小鼠肝臟組織AMPK、CREB、GSK3β蛋白表達(dá)情況:與野生型小鼠相比，TSHR基因敲除小鼠的肝臟組織總AMPK、CREB、GSK3β蛋白表達(dá)水平均沒(méi)有顯著變化(P＞0.05)，但磷酸化AMPK、GSK3β蛋白表達(dá)水平均明顯增加，磷酸化CREB蛋白表達(dá)水平明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　7.TSH刺激對(duì)HepG2細(xì)胞PEPCK、G6PmRNA表達(dá)的影響:0.2μmTSH刺激HepG2細(xì)胞20小時(shí)后，He