Spag6基因敲除對小鼠內(nèi)耳和中耳的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 Sperm-Associated Antigen6(Spag6)基因敲除致小鼠內(nèi)耳極性缺陷和聽力損失
　　目的：
　　Sperm-Associated Antigen6（Spag6)基因編碼中心微管蛋白，對纖毛和鞭毛的運(yùn)動十分重要。最近研究發(fā)現(xiàn)，Spag6對纖毛的發(fā)生、調(diào)節(jié)纖毛小根的排列方向和細(xì)胞的平面極性十分重要。內(nèi)耳聽覺上皮具有聽覺形成所需要的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)最典型的平面極性，然而，Spag6在內(nèi)耳是否有作用目前

2、尚未見報(bào)道。本研究使用Spag6基因敲除小鼠探究Spag6在小鼠內(nèi)耳中的作用。
　　方法：
　　1.聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)和耳蝸微音電位(cochlear microphonics，CM)分別檢測同窩Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的聽力。ABR使用click聲和短純音分別進(jìn)行刺激;CM使用click聲進(jìn)行刺激，記錄結(jié)果。
　　2.對內(nèi)耳基底膜進(jìn)行鋪片及免疫

3、熒光染色，顯示毛細(xì)胞表皮板下的微管系統(tǒng)，觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的微管系統(tǒng)有無不同。
　　3.對出生1天的同窩Spag6+/+和Spag6-/-小鼠耳蝸基底膜進(jìn)行鋪片，行免疫熒光染色，觀察核心極性蛋白FZD6的分布有無不同。
　　4.對內(nèi)耳基底膜進(jìn)行鋪片及免疫熒光染色，觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的形態(tài)和極性，并對纖毛束的偏移角度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　5.內(nèi)耳基底膜行免疫熒光染色和掃

4、描電鏡，觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的一對中心粒、動纖毛和纖毛束三者之間的位置關(guān)系，并對動纖毛相對于纖毛束的偏移角度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　結(jié)果：
　　1.Spag6+/+小鼠聽力結(jié)果:ABR的click聲刺激反應(yīng)平均閾值為30.00±2.21 dB，ABR純音刺激4k、8k、16k、32kHz的聽力閾值分別為63.33±2.20、37.78±2.78、32.22±2.78和72.22±1.47dB，CM平均

5、閾值40±4.08dB; Spag6-/-小鼠聽力結(jié)果:ABR的click聲刺激反應(yīng)平均閾值70.71±4.14 dB，ABR純音4k、8k、16k、32kHz的聽力閾值分別為85.71±2.29、74.29±2.97、72.86±3.60和90dB，三只純合小鼠CM在80dB均無法引出。Spag6+/+小鼠和Spag6-/-小鼠的ABR及CM結(jié)果均具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.Spag6+/+小鼠毛細(xì)胞表皮板的微管系統(tǒng)，以中心粒

6、和動纖毛為中心，向細(xì)胞質(zhì)放射狀排列。而Spag6-/-小鼠毛細(xì)胞表皮板的微管系統(tǒng)發(fā)生了改變，微管排列錯(cuò)亂，并隨動纖毛和中心粒的移位發(fā)生了偏移。
　　3.Spag6+/+小鼠的核心極性蛋白FZD6呈極性分布:;而Spag6-/-小鼠FZD6蛋白分布失去極性，在細(xì)胞膜上隨機(jī)分布。
　　4.Spag6+/+小鼠基底膜毛細(xì)胞的一排內(nèi)毛細(xì)胞和三排外毛細(xì)胞排列整齊，“Λ”字形纖毛束開口方向朝向內(nèi)側(cè)，即耳蝸神經(jīng)的方向;耳蝸基底膜寬度由頂轉(zhuǎn)

7、向底轉(zhuǎn)變窄。而Spag6-/-小鼠的毛細(xì)胞大量積聚在耳蝸的項(xiàng)轉(zhuǎn)區(qū)域，聽覺上皮區(qū)域明顯變寬;同時(shí)Spag6-/-小鼠毛細(xì)胞纖毛的極性發(fā)生了很大偏移，表現(xiàn)為方向各異。
　　5.Spag6+/+小鼠的一對中心粒所在直線與組織極性軸平行，動纖毛位于纖毛束“Λ”字形的頂點(diǎn)。而Spag6-/-小鼠的一對中心粒所在的直線不再與組織極性軸平行，動纖毛與纖毛束的相對位置關(guān)系發(fā)生改變。
　　結(jié)論：
　　Spag6基因缺失可使小鼠聽力損失，

8、這種作用可能是通過參與調(diào)節(jié)小鼠內(nèi)耳聽覺上皮的平面極性實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分 Sperm-Associated Antigen6(Spag6)基因敲除導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)中耳炎
　　目的：
　　Sperm-Associated Antigen6(Spag6)基因編碼中心微管蛋白，對纖毛和鞭毛的運(yùn)動十分重要。最近研究發(fā)現(xiàn)，Spag6對纖毛的發(fā)生、纖毛小根排列的方向和平面細(xì)胞極性的調(diào)節(jié)十分重要。極性排列的纖毛對中耳的正常功能具有重要

9、意義，可以抵御細(xì)菌感染和清除中耳分泌物;纖毛結(jié)構(gòu)或功能異?？蓪?dǎo)致中耳炎。然而，Spag6基因?qū)τ谥卸淖饔弥两裎匆妶?bào)道。本研究利用Spag6基因敲除小鼠，探討Spag6基因缺失對小鼠中耳的影響。
　　方法：
　　1.RT-PCR和免疫熒光檢測Spag6在Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳的表達(dá)。
　　2.耳鏡觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的鼓膜和中耳腔，制作HE切片染色判斷中耳炎的發(fā)生情況。

10、　　3.灌注固定后取Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳及咽鼓管的纖毛上皮，使用掃描電鏡觀察纖毛情況。
　　4.透射電鏡觀察Spag6+/+和Spag6-小鼠的中耳及咽鼓管的纖毛小根及一對中心微管的方向。
　　5.對Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳粘膜上皮進(jìn)行鋪片和免疫熒光染色，觀察核心極性蛋白FZD6的分布情況。
　　6.分別使用細(xì)菌培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)、PCR鑒定、粘液卡紅染色、Realtime-PC

11、R、咽鼓管角度測量的方法，分別觀察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳的細(xì)菌情況、杯狀細(xì)胞的分布情況、粘液因子Mucin5ac和Mucin5b的表達(dá)情況以及咽鼓管角度是否異常。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR和免疫熒光染色結(jié)果顯示:Spag6在Spag6+/+小鼠中耳和咽鼓管的纖毛上皮有表達(dá)且表達(dá)于纖毛;RT-PCR和免疫熒光均未檢測到Spag6基因在Spag6-/-小鼠的中耳或咽鼓管有表達(dá)。
　　2.耳鏡顯示

12、1月齡Spag6+/+小鼠鼓膜完好光滑，光錐明顯，中耳腔未見異常;而同窩Spag6-/-小鼠透過鼓膜可見氣泡及積液;HE切片染色顯示Spag6-/-小鼠中耳腔及咽鼓管內(nèi)有滲出液體和炎性細(xì)胞，6月齡小鼠出現(xiàn)鼓室硬化，同窩Spag6+/+小鼠鼓室腔未見明顯異常。
　　3.掃描電鏡顯示生后25天Spag6-/-小鼠的鼓室上皮纖毛出現(xiàn)倒伏錯(cuò)亂，部分區(qū)域稀疏;而野生型小鼠纖毛密度未見降低，纖毛方向一致;Spag6-/-小鼠的骨岬的纖毛已經(jīng)喪

13、失，而Spag6+/+小鼠仍然存在。
　　4.透射電鏡顯示Spag6-/-小鼠中耳上皮的纖毛小根方向錯(cuò)亂，纖毛的一對中心微管所在直線方向不一致;而Spag6+/+小鼠纖毛小根的方向一致，所有纖毛的一對中心微管所在直線平行，基本指向同一方向。
　　5.免疫熒光染色顯示FZD6蛋白在Spag6+/+小鼠中耳的纖毛上皮細(xì)胞的胞膜上呈極性分布，而FZD6蛋白在Spag6-/-小鼠的分布則失去極性。
　　6.細(xì)菌培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)和

14、使用PCR鑒定小鼠中耳鼓室細(xì)菌顯示，Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳腔中均存在卡他莫拉菌，且菌落數(shù)量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;粘液卡紅染色顯示Spag6-/-小鼠的杯狀細(xì)胞較Spag+/+小鼠未見明顯增多;realtime-PCR顯示粘液因子Mucin5ac和Mucin5b的mRNA在Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳表達(dá)無明顯差異;咽鼓管角度測量顯示Spag+/+和Spag6-/-小鼠的咽鼓管角度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。