成骨細(xì)胞與血清B-ALP在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠發(fā)病過程中的作用.pdf

1、目的:糖尿病性骨質(zhì)疏松是糖尿病在骨骼系統(tǒng)的并發(fā)癥。2型糖尿病(T2DM)糖代謝異?？蓪?dǎo)致體內(nèi)骨代謝異常,從而導(dǎo)致或促進(jìn)骨質(zhì)疏松(OP)發(fā)生,T2DM患者OP發(fā)生率明顯升高,但機(jī)制不明。骨組織代謝旺盛,不斷進(jìn)行舊骨更新,新骨形成,這一骨轉(zhuǎn)換過程主要包括骨吸收和骨形成,骨吸收由破骨細(xì)胞完成,骨形成由成骨細(xì)胞完成,測(cè)定循環(huán)中骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物水平可評(píng)價(jià)骨轉(zhuǎn)換水平,其中僅存在于成骨細(xì)胞膜的骨特異性堿性磷酸酶(B-ALP),是成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志酶,

2、B-ALP在骨形成過程中從成骨細(xì)胞內(nèi)釋放入細(xì)胞外液,促進(jìn)骨基質(zhì)形成和礦化。本研究在建立2型糖尿病大鼠模型去卵巢后復(fù)制糖尿病性骨質(zhì)疏松模型基礎(chǔ)上,進(jìn)行體外成骨細(xì)胞(OB)培養(yǎng),觀察OB數(shù)量、形態(tài)和生長活力變化,應(yīng)用ELISA方法測(cè)定血清B-ALP水平,從細(xì)胞和血清學(xué)水平觀察在不同時(shí)間正常、骨質(zhì)疏松、2型糖尿病、2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠中成骨細(xì)胞及B—ALP變化,探討成骨細(xì)胞與B-ALP在2型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。
　　

3、 方法:將100只2.5—3月齡健康雌性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)24只,正常去卵巢組(NOVX組)26只,2型糖尿病對(duì)照組(DC組)24只,2型糖尿病去卵巢組(DOVX組)26只,組間大鼠體重?zé)o顯著差異。實(shí)驗(yàn)期間NC組和NOVX組喂以常規(guī)飼料,DC組和DOVX組大鼠高糖高脂飼料(常規(guī)飼料中加入20％蔗糖、15％熟豬油、2.5％膽固醇)喂養(yǎng)8周,禁食12小時(shí)后左下腹腔給予STZ(STZ,0.1mmol

4、/L,檸檬酸鈉配制,pH4.2)30mg/kg注射。于實(shí)驗(yàn)第9周末選取尾靜脈空腹血糖(FBG)≥7.8mmol/L且伴有胰島素抵抗者作為T2DM動(dòng)物模型,T2DM動(dòng)物模型復(fù)制成功1周后無菌條件下NOVX組和DOVX組大鼠麻醉后行去卵巢手術(shù)。手術(shù)當(dāng)天(0周)NC組、DC組各取一只大鼠收集骨髓細(xì)胞行體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)作為基值。實(shí)驗(yàn)共持續(xù)22周,去卵巢后第0、2、4、6、8、10、12周末各組大鼠測(cè)體重、血糖、B-ALP、胰島素(INS)；第4

5、、8、12周末各組隨機(jī)選取一只大鼠拉頸處死行成骨細(xì)胞培養(yǎng),成骨細(xì)胞培養(yǎng)后倒置顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)變化,傳代至第三代時(shí)堿性磷酸酶染色鑒定成骨細(xì)胞,并用MTT法判斷成骨細(xì)胞生長活力。使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示,計(jì)量資料多組間比較采用方差分析或秩檢驗(yàn),p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1實(shí)驗(yàn)第9周末各組FBG:DC組和DOVX組FBG高

6、于NC組和NOVX組,有顯著差異(P<0.01),DC組、DOVX組INS水平高于NC組、NOVX組,有顯著差異(P<0.05),表明T2DM模型復(fù)制成功。
　　 2實(shí)驗(yàn)第10周末(去卵巢后0周)各組血清B-ALP濃度、成骨細(xì)胞生長情況:各組之間血清B-ALP濃度無顯著差異(P>0.05)；行去卵巢0周大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察NC組成骨細(xì)胞較DC組生長好,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:第三代成骨細(xì)胞接種僅第3、4天NC組成骨細(xì)胞

7、生長活力高于DC組,有顯著差異(P<0.05)。
　　 3實(shí)驗(yàn)第12周末(去卵巢后2周)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo):DOVX組FBG高于NC組,但無顯著差異(P>0.05),DC組FBG高于NC組、NOVX組,有顯著差異(P<0.05),DOVX組FBG較NOVX組有顯著差異(P<0.05),NC組FBG與NOVX組無顯著差異(P>0.05),DC組FBG高于DOVX組,有顯著差異(P<0.05)；DC組INS濃度顯著高于NC、NOVX、DO

8、VX組(p<0.05),NC組、DOVX組INS濃度高于NOVX組,有顯著差異(p<0.05)；DC組血清B-ALP濃度低于NC組,NC組、DC組、DOVX組之間無顯著差異(P>0.05),NOVX組血清B-ALP濃度高于NC組、DC組、DOVX組,有顯著差異(P<0.05)。
　　 4實(shí)驗(yàn)第14周末(去卵巢后4周)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo):DC組、DOVX組FBG較NC組、NOVX組無顯著差異(P>0.05),NC組FBG與NOVX組、D

9、C組FBG與DOVX組之間均無顯著差異(P>0.05)；DC組INS濃度顯著高于NC、NOVX、DOVX組(p<0.05),其余各組兩兩之間比較無顯著差異(p>0.05)；NOVX組血清B-ALP濃度高于DOVX組,有顯著差異(P<0.05),NOVX組血清B-ALP濃度高于NC組,DC組血清B—ALP濃度低于NC組、DOVX組但均無顯著差異(P>0.05)；行去卵巢后4周大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察NC組、NOVX組成骨細(xì)胞

10、較DC組、DOVX組生長好,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:第三代成骨細(xì)胞接種1、2、3、5、6、7天NOVX組成骨細(xì)胞生長活力高于NC組,有顯著差異(P<0.05),第三代成骨細(xì)胞接種1-7天DC組成骨細(xì)胞生長活力低于NC組,DOVX組成骨細(xì)胞生長活力高于DC組,均有顯著差異(P<0.05)。
　　 5實(shí)驗(yàn)第16周末(去卵巢后6周)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo):DC組、DOVX組FBG高于NC組、NOVX組,有顯著差異(P<0.05),NC組FBG與NOVX

11、組、DC組FBG與DOVX組之間均無顯著差異(P>0.05)；各組INS濃度之間兩兩比較無顯著差異(p>0.05)；NOVX組血清B-ALP濃度高于NC組,DC組血清B-ALP濃度低于NC組、DOVX組,但均無顯著差異(P>0.05),NOVX組血清B-ALP濃度高于DOVX組,有顯著差異(P<0.05)。
　　 6實(shí)驗(yàn)第18周末(去卵巢后8周)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo):DC組、DOVX組FBG高于NC組、NOVX組,有顯著差異(P<0.0

12、5),NC組FBG與NOVX組、DC組FBG與DOVX組之間均無顯著差異(P>0.05)；DC、DOVX組INS濃度顯著高于NOVX組(p<0.05),其余各組兩兩之間比較無顯著差異(p>0.05)；NOVX組血清B-ALP濃度高于DOVX組,但無顯著差異(P>0.05),DC組血清B-ALP濃度低于NC組、DOVX組,有顯著差異(P<0.05)；行去卵巢后8周大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察NOVX組成骨細(xì)胞較其它三組成骨細(xì)胞生

13、長好,DC組成骨細(xì)胞生長最差。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:第三代成骨細(xì)胞接種第2、3、4、5、7天NOVX組成骨細(xì)胞生長活力高于NC組,DOVX組成骨細(xì)胞生長活力高于DC組,均有顯著差異(P<0.05),第三代成骨細(xì)胞接種第1-7天DC組成骨細(xì)胞生長活力低于NC組有顯著差異(P<0.05)。
　　 7實(shí)驗(yàn)第20周末(去卵巢后10周)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo):各組FBG之間均無顯著差異(P>0.05),NC組FBG與NOVX組、DC組FBG與DOVX組之

14、間均無顯著差異(P>0.05)；各組INS濃度之間兩兩比較無顯著差異(p>0.05)；NOVX組、DOVX組血清B-ALP濃度高于NC組,DC組血清B-ALP濃度低于NC組、DOVX組,但均無顯著差異(P>0.05)。
　　 8實(shí)驗(yàn)第22周末(去卵巢后12周)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo):各組FBG之間均無顯著差異(P>0.05),NC組FBG與NOVX組、DC組FBG與DOVX組之間均無顯著差異(P>0.05)；各組INS濃度之間兩兩比較無顯

15、著差異(p>0.05)；NOVX組、DC組血清B-ALP濃度高于NC組、DOVX組,DOVX組血清B-ALP濃度低于NC組,但均無顯著差異(P>0.05)；行去卵巢后12周大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞生長情況依次是DOVX組、NC組、NOVX組、DC組,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:第三代成骨細(xì)胞接種第1-7天NOVX組成骨細(xì)胞生長活力高于NC組,有顯著差異(P<0.05),第三代成骨細(xì)胞接種第1、2、3、4、6、7天DC組成骨細(xì)胞