睪丸內(nèi)注射法建立轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指通過人工的方法將外源基因?qū)雱?dòng)物染色體基因組，使之穩(wěn)定表達(dá)并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。隨著技術(shù)的進(jìn)步，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域都有著廣泛的研究和應(yīng)用前景，因此科學(xué)家們一直在探索一種更簡便易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)用而又高效的轉(zhuǎn)基因方法。近年來，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移己成為用于基因治療、生物學(xué)分析等領(lǐng)域非常受歡迎的一種技術(shù)。脂質(zhì)體是一種新型的轉(zhuǎn)染介質(zhì)，可以通過細(xì)胞的內(nèi)吞或吞噬作用，將所攜帶的目標(biāo)基因?qū)爰?xì)胞中。因其對(duì)細(xì)胞毒性低，對(duì)轉(zhuǎn)

2、染的核酸類型和分子量有很高的包容性；且易于制備、免疫原性低、轉(zhuǎn)染操作簡單，故應(yīng)用范圍越來越廣泛，不僅用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，也可用于永久表達(dá)系的建立。 精原干細(xì)胞(spermatogonialstemcells，SSCs)是位于睪丸曲細(xì)精管基膜上既能自增殖維持自身群體恒定，又能定向分化產(chǎn)生分化型精原細(xì)胞的雄性生殖系干細(xì)胞，其白增殖過程幾乎可以貫穿機(jī)體的整個(gè)生命而又兼有向子代傳遞遺傳信息的能力。為了探討在體睪丸曲精細(xì)管內(nèi)注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

3、的可行性。首先摸索了小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)及培養(yǎng)條件。轉(zhuǎn)染液采用脂質(zhì)體包裹綠色熒光蛋白報(bào)告基因pIRES-EGFP質(zhì)粒。為篩選最佳轉(zhuǎn)染效果，采用不同配比的plRES-EGFP質(zhì)粒與脂質(zhì)體組成轉(zhuǎn)染試劑，分別在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞活力與轉(zhuǎn)染率。結(jié)果顯示與支持細(xì)胞共培養(yǎng)能促進(jìn)SSCs的存活和增殖，通過飼養(yǎng)層細(xì)胞輔助培養(yǎng)是體外培養(yǎng)SSCs較好的手段。脂質(zhì)體Lipofectamine2000濃度高，對(duì)細(xì)胞有毒性作用，濃度低

4、，轉(zhuǎn)染效率低。通過細(xì)胞活力計(jì)數(shù)，篩選出轉(zhuǎn)染液中DNA與脂質(zhì)體Lipofectamine2000的最佳配比為2μg:5μl。在轉(zhuǎn)染后36h，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率最高，達(dá)到31.5％。 在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)小鼠進(jìn)行睪丸內(nèi)注射。A組小鼠進(jìn)行外科手術(shù)，在體視顯微鏡下對(duì)小鼠曲精細(xì)管進(jìn)行注射，轉(zhuǎn)染液混有1％臺(tái)盼藍(lán)，起指示作用。每個(gè)睪丸選2～3個(gè)注射點(diǎn)，使睪丸表面約30％以上的曲細(xì)精管變藍(lán)，考慮到小鼠睪丸的容積，每只小鼠的注射量為40μl。B組小鼠不

5、進(jìn)行外科手術(shù)，采用多點(diǎn)多次注射方式，直接進(jìn)行睪丸注射，每三天注射一次，共進(jìn)行三次注射，每只小鼠每次注射量為4μl。PCR結(jié)果顯示A組F1代轉(zhuǎn)基因陽性率31.4％，F(xiàn)2代轉(zhuǎn)基因陽性率11.7％，B組F1代轉(zhuǎn)基因陽性率17.1％，F(xiàn)2代轉(zhuǎn)基因陽性率12.5％。證實(shí)曲精細(xì)管注射法可成功制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，轉(zhuǎn)基因效率較高。無須外科手術(shù)，通過直接睪丸多點(diǎn)多次反復(fù)注射，證實(shí)可成功制備含有外源基因的轉(zhuǎn)基因后代，這為大型家畜的轉(zhuǎn)基因技術(shù)開辟了一條新途徑。