2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、PLCD1是Plcd1基因編碼的蛋白,屬于磷脂酶C家族δ亞型,在磷酸肌醇代謝和Ca2+平衡中發(fā)揮重要作用。我們的目標(biāo)是建立Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠,結(jié)合前期本實驗室自主培育的Plcd1缺失小鼠snthr-1Bao,在整體動物水平研究Plcd1的生物學(xué)功能。本實驗從Plcd1表達(dá)載體的構(gòu)建和顯微注射法制備Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠兩個方面介紹如下:
   第一部分pEF6/V5-His-Plcd1真核表達(dá)載體的構(gòu)建。
   目的:擴

2、增Plcd1目的基因片段,獲得能在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)PLCD1融合蛋白的表達(dá)載體。方法:通過RT-PCR方法獲得Plcd1目的片段,將其與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR檢測及DNA測序,獲得pMD19-T-Plcd1重組質(zhì)粒;以重組質(zhì)粒為模板,通過引物設(shè)計及PCR方法在Plcd1目的基因兩端引入合適的酶切位點,將純化的PCR產(chǎn)物和pEF6/V5-His-LacZ表達(dá)載體分別進行酶切、純化、回收、連接

3、、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,再經(jīng)Amp篩選、PCR檢測及DNA測序,獲得pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體;在此基礎(chǔ)上,通過電轉(zhuǎn)染的方法,將pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體導(dǎo)入L929細(xì)胞,經(jīng)間接免疫熒光法檢測PLCD1融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果:本實驗成功擴增了長2271bp的Plcd1目的片段,將其與pMD19-T載體連接獲得了pMD19-T-Plcd1克隆載體;以克隆載體為模板,通過PCR方法分別在Plcd1目的基因上下

4、游引入了SpeI和BstBI兩個酶切位點,PCR產(chǎn)物與pEF6/V5-His-Lac Z經(jīng)酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選及測序等一系列步驟,最終獲得了pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體;電轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞后,經(jīng)間接免疫熒光法檢測到PLCD1融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。結(jié)論:本實驗成功擴增了全長2271bp的Plcd1目的片段,并先后構(gòu)建了pMD19-T-Plcd1克隆載體及能在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白的pEF6/V5-His-Plc

5、d1表達(dá)載體。
   第二部分顯微注射法制備Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠。
   目的:在成功獲得pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,通過顯微注射法獲得Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠。方法:pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體經(jīng)酶切、電泳、純化后,選擇包括hEF-1α啟動子、Plcd1目的片段、V5、His-tag和BGH的線性構(gòu)件用于顯微注射;供體、受體小鼠經(jīng)同步發(fā)情或超排卵處理,采集受精卵用于顯微注射;經(jīng)顯微注射

6、后的受精卵適當(dāng)培養(yǎng),選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行受體小鼠的輸卵管移植;出生小鼠經(jīng)基因組DNA提取及PCR檢測,初步確認(rèn)獲得Founder轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果:pEF6/V5-His-Plcd1經(jīng)NruI和AseI雙酶切純化后,成功獲得了用于顯微注射的目的片段;顯微注射共681枚受精卵,經(jīng)培養(yǎng)后多數(shù)溶解,僅存活優(yōu)質(zhì)胚胎393枚,存活率為57.7%;存活胚胎全部用于移植,共移植了18只受體小鼠,13只小鼠懷孕,獲得82只仔鼠。經(jīng)PCR初步檢測,成功獲得了1

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