運(yùn)用顯微注射法和體內(nèi)電穿孔法制備胰蛋白酶原Ⅱ轉(zhuǎn)基因小鼠的研究.pdf

1、進(jìn)行胰腺外分泌功能研究是為了從生理角度觀察胰腺正常分泌過(guò)程或從病理生理角度來(lái)探討胰腺相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制。胰腺外分泌部分泌的消化酶中胰蛋白酶以酶原形式釋放。胰蛋白酶原是一個(gè)觸發(fā)酶，可以激活胰液中許多其他的酶原，在消化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。胰蛋白酶原分為胰蛋白酶原Ⅰ和胰蛋白酶原Ⅱ，其中胰蛋白酶原Ⅱ的分泌量在急性胰腺炎時(shí)比正常升高約50倍，因而胰蛋白酶原Ⅱ分泌量的變化是急性胰腺炎靈敏、特異的標(biāo)志和檢測(cè)指標(biāo)。檢測(cè)胰蛋白酶原Ⅱ分泌量的變化可用于急性胰

2、腺炎的診斷及其嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)。 本課題的目的在于建立一種能夠觀察胰腺外分泌功能的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，借助該動(dòng)物模型通過(guò)檢測(cè)活體內(nèi)胰蛋白酶原Ⅱ表達(dá)水平變化(升高或降低)以監(jiān)測(cè)胰腺外分泌相關(guān)疾病(如胰腺炎、胰腺癌)的發(fā)生或治愈，從而為研究胰腺外分泌功能的生理機(jī)理和與其相關(guān)的疾病發(fā)病機(jī)制以及篩選治療上述疾病的藥物提供理想的實(shí)驗(yàn)體系。 本研究分別運(yùn)用顯微注射法和曲細(xì)精管內(nèi)注射輔之體內(nèi)電穿孔法來(lái)制備胰蛋白酶原Ⅱ轉(zhuǎn)基因小鼠。 本實(shí)驗(yàn)

3、室以質(zhì)粒pEGFP-N1為載體，構(gòu)建以大鼠彈性蛋白酶Ⅰ啟動(dòng)子(PEL)驅(qū)動(dòng)胰蛋白酶原Ⅱ信號(hào)肽(Pre)、并連接有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因的載體質(zhì)粒pPEL-Pre-EGFP。為獲取轉(zhuǎn)基因目的片斷，本研究對(duì)已構(gòu)建的載體進(jìn)行酶切鑒定、測(cè)序、比對(duì)分析，并轉(zhuǎn)染體外細(xì)胞進(jìn)行功能性檢測(cè)。 pPEL-Pre-EGFP的酶切和測(cè)序鑒定通過(guò)三酶切pPEL-Pre-EGFP獲得轉(zhuǎn)基因用片段PEL-Pre-EGFP(2308bp)，經(jīng)測(cè)

4、序、比對(duì)分析，PEL、Pre和EGFP均與GenBank中所提交序列同一性程度極高，表明其構(gòu)建正確。 pPEL-Pre-EGFP功能性體外檢測(cè)將轉(zhuǎn)染劑與pPEL-Pre-EGFP混合轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞株(人胰腺癌細(xì)胞株)，24h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，預(yù)示外源基因在SW1990上能夠正常表達(dá)，這為下一步制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奠定了基礎(chǔ)。 顯微注射法制備PEL-Pre-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠本研究共取受精卵1610枚，其中可用

5、于顯微注射用的受精卵1280枚，注射DNA后成活的受精卵共507枚；每只假孕雌鼠移植約20個(gè)受精卵，共移植24只假孕雌鼠，其中7只懷孕，妊娠率為29.2％，共獲得F0代小鼠18只，出生率為3.6％；F0代小鼠經(jīng)檢測(cè)，PCR陽(yáng)性6只，SouthernBlotting陽(yáng)性1只(雄性)，SouthernBlotting陽(yáng)性率為5.6％。 體內(nèi)電穿孔法制備PEL-Pre-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)曲細(xì)精管內(nèi)注射輔之體內(nèi)電穿孔法共獲得10只雄

6、鼠，2周后從與之交配的20只雌鼠(1♂：2♀)中獲得妊娠雌鼠14只，妊娠率70％，產(chǎn)下仔鼠115只；F0代小鼠經(jīng)檢測(cè)，PCR陽(yáng)性7只，SouthernBlotting陽(yáng)性1只(雄性)，SouthernBlotting陽(yáng)性率0.87％。 EGFP可視化檢測(cè)獲得的2只Southern雜交陽(yáng)性鼠經(jīng)暴露胰腺組織部位，在整體成像儀下僅顯微注射法獲得的陽(yáng)性小鼠胰腺組織觀察到綠色熒光，將其胰腺組織制作冰凍組織切片，在倒置相差熒光顯微鏡下可觀測(cè)