mSAP轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)是一項(xiàng)新興的生物技術(shù)，是常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)在研究層次上的拓展和延伸。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出現(xiàn)，使人類可以通過(guò)基因重組的各種方法人為的改造動(dòng)物基因組，在動(dòng)物活體水平上研究有關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與功能，是一個(gè)四維時(shí)空的研究體系，為從分子到個(gè)體的各個(gè)層次，多維的研究基因提供了新的方法和思路。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究揭開(kāi)了生命科學(xué)研究的新篇章，其多樣性和重復(fù)性差也反映了客觀世界的復(fù)雜性和多樣性，為人類提供了更多展示自然規(guī)律的途徑，顯示出美好的

2、應(yīng)用前景。 血清淀粉樣p物質(zhì)(serumamyloidpcomponent，SAP)作為一種古老的蛋白質(zhì)，與C反應(yīng)蛋白(CRP)構(gòu)成血清正五聚體蛋白家族，其系統(tǒng)發(fā)生學(xué)非常保守，具有重要的生理功能，與炎癥、凝血及多種淀粉樣病變有關(guān)。 小鼠與人基因同源性較高，小鼠的許多疾病模型與人類同種疾病有著較高的可比性，這為人類研究疾病及某個(gè)基因的功能提供了一條新的途徑。因此我們?cè)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，通過(guò)受精卵原核顯微注射法將外源基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)

3、，該方法首先由英國(guó)的Clark為首的研究小組提出，旨在研究外源基因協(xié)同作用以提高其表達(dá)水平。 本研究以C57BL/6J小鼠為研究對(duì)象，RT-PCR獲得小鼠SAP基因，將其正向插入pCMV-Tag5A真核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化宿主菌，挑選克隆，抽提質(zhì)粒，用BamHI和XHoI雙酶切鑒定出陽(yáng)性克隆后，經(jīng)測(cè)序正確。然后借助受精卵原核顯微注射法將經(jīng)BciVI限制性核酸內(nèi)切酶酶切后回收的2.7kb線性片斷導(dǎo)入C57×CBAF1代小鼠受精卵雄原核

4、，移植入代孕母鼠，所生127只小鼠，其中PCR鑒定獲得10只轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，整合率為7.87％。然后遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)律PCR鑒定F1、F2、F3代所生小鼠，建立三個(gè)轉(zhuǎn)基因純合子founder，最終借助免疫沉淀法(immunoprecipitation，IP)和免疫印跡法(Westernblotting,WB)在蛋白水平上確定了兩個(gè)純合子founder小鼠。成功建立了小鼠血清淀粉樣p物質(zhì)轉(zhuǎn)基因小鼠純合子模型，為今后研究該基因的功能提供了良