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文檔簡介
1、轉基因動物技術是一項新興的生物技術,是常規(guī)分子生物學技術和基因工程技術在研究層次上的拓展和延伸。轉基因動物的出現(xiàn),使人類可以通過基因重組的各種方法人為的改造動物基因組,在動物活體水平上研究有關基因的結構與功能,是一個四維時空的研究體系,為從分子到個體的各個層次,多維的研究基因提供了新的方法和思路。轉基因動物研究揭開了生命科學研究的新篇章,其多樣性和重復性差也反映了客觀世界的復雜性和多樣性,為人類提供了更多展示自然規(guī)律的途徑,顯示出美好的
2、應用前景。 血清淀粉樣p物質(serumamyloidpcomponent,SAP)作為一種古老的蛋白質,與C反應蛋白(CRP)構成血清正五聚體蛋白家族,其系統(tǒng)發(fā)生學非常保守,具有重要的生理功能,與炎癥、凝血及多種淀粉樣病變有關。 小鼠與人基因同源性較高,小鼠的許多疾病模型與人類同種疾病有著較高的可比性,這為人類研究疾病及某個基因的功能提供了一條新的途徑。因此我們設計本實驗,通過受精卵原核顯微注射法將外源基因導入動物體內
3、,該方法首先由英國的Clark為首的研究小組提出,旨在研究外源基因協(xié)同作用以提高其表達水平。 本研究以C57BL/6J小鼠為研究對象,RT-PCR獲得小鼠SAP基因,將其正向插入pCMV-Tag5A真核表達載體上,轉化宿主菌,挑選克隆,抽提質粒,用BamHI和XHoI雙酶切鑒定出陽性克隆后,經測序正確。然后借助受精卵原核顯微注射法將經BciVI限制性核酸內切酶酶切后回收的2.7kb線性片斷導入C57×CBAF1代小鼠受精卵雄原核
4、,移植入代孕母鼠,所生127只小鼠,其中PCR鑒定獲得10只轉基因陽性小鼠,整合率為7.87%。然后遵循孟德爾遺傳規(guī)律PCR鑒定F1、F2、F3代所生小鼠,建立三個轉基因純合子founder,最終借助免疫沉淀法(immunoprecipitation,IP)和免疫印跡法(Westernblotting,WB)在蛋白水平上確定了兩個純合子founder小鼠。成功建立了小鼠血清淀粉樣p物質轉基因小鼠純合子模型,為今后研究該基因的功能提供了良
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