睪丸注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠效率的研究及抗菌肽Thanatin轉(zhuǎn)基因小鼠的建立.pdf

1、在過去的近30年中，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在哺乳動物基因表達方面的研究應(yīng)用，已經(jīng)成為實驗生物學(xué)及應(yīng)用生物學(xué)領(lǐng)域最為顯著的進展之一。傳統(tǒng)的制作轉(zhuǎn)基因動物方法有顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法和胚胎干細(xì)胞法等，但每種方法都有其缺陷，限制了其在今后轉(zhuǎn)基因動物研究中的廣泛應(yīng)用。通過睪丸注射法對體內(nèi)生殖細(xì)胞進行外源基因轉(zhuǎn)染是近些年來發(fā)展起來的一種進行轉(zhuǎn)基因動物研究的新方法。由于其操作簡便、成本低廉、效率較高且適于大量生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)點而越來越受到關(guān)注。但由于該

2、方法起步較晚，目前還存在許多問題。因此，對該方法進行研究和完善，對今后制作和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，培育抗病動物品種以及通過建立轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)珍貴蛋白等都具有重要意義。 本研究共分三部分： 第一部分：小鼠精子形成各階段轉(zhuǎn)基因效率的研究 本試驗對小鼠體內(nèi)生殖細(xì)胞進行外源基因轉(zhuǎn)染，研究精子形成過程中制作轉(zhuǎn)基因小鼠的效率。首先運用睪丸注射法將被脂質(zhì)體包裹的綠色熒光蛋白表達載體(pIRES2-EGFP)注射到公鼠睪丸及

3、附睪內(nèi)，然后根據(jù)精子形成不同階段，分別于注射后7d、16d、30d和42d與發(fā)情母鼠合籠，利用PCR和Southern印跡方法對新生小鼠進行基因組DNA檢測。在各階段所得新生小鼠中PCR陽性率分別為6.82％、0、56.86％和、42.86％，Southern印跡檢測陽性率為分別為6.82％、0、47.06％、34.69％，經(jīng)活體熒光成像系統(tǒng)及熒光顯微鏡分析，轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)綠色熒光表達。通過比較精子生成各階段轉(zhuǎn)基因效率高低，為以后通過用

4、睪丸內(nèi)注射法轉(zhuǎn)染雄性生殖細(xì)胞高效制作轉(zhuǎn)基因動物提供了理論依據(jù)。 第二部分：睪丸注射法在不同生精周期制作轉(zhuǎn)基因小鼠效率的研究 運用睪丸注射法將被脂質(zhì)體包裹的綠色熒光蛋白表達載體(pIRES2-EGFP)注射到公鼠睪丸內(nèi)，然后根據(jù)小鼠精子的形成周期，分別于注射后第42d、84d、126d、168d和210d即注射后連續(xù)5個周期內(nèi)與正常發(fā)情母鼠合籠，利用PCR和Southern印跡方法對新生小鼠進行基因組DNA的跟蹤檢測。在各

5、階段所得新生小鼠中PCR陽性率分別為36.36％、17.78％、12.50％、10.87％、4.65％，Southern印跡檢測陽性率為分別為31.82％、13.33％、8.33％、6.52％、2.33％，經(jīng)活體熒光成像系統(tǒng)及熒光顯微鏡分析，轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)綠色熒光表達。通過比較不同精子生成周期的轉(zhuǎn)基因效率，初步表明精原干細(xì)胞可以長時間攜帶外源基因，但其效率隨時間的延長而明顯降低，這為今后通過用睪丸內(nèi)注射法轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞制作轉(zhuǎn)基因動物提供

6、了基礎(chǔ)理論。 第三部分：睪丸注射法建立抗菌肽Thanatin轉(zhuǎn)基因小鼠的初步研究 人工合成抗菌肽Thanatin基因的三條片段，利用重疊延伸PCR擴增技術(shù)得到完整的Thanatin基因，通過分子克隆方法構(gòu)建出pIRES2-EGFP-Thanatin重組表達載體。然后與脂質(zhì)體混合，采用睪丸打點注射將新構(gòu)建的抗菌肽基因注入小鼠睪丸內(nèi)，共注射公鼠5只。6周后與雌鼠交配，對F1代新生小鼠進行斷尾，提取尾尖基因組DNA，利用PCR

7、和Southern印跡方法對其進行檢測，從檢測陽性小鼠中隨機挑選公、母鼠各3只分別與正常小鼠交配，用PCR方法對F2代進行檢測。結(jié)果得到的52只F1代鼠中PCR檢測陽性率為38.46％，Southern印跡檢測陽性率為30.77％；轉(zhuǎn)基因陽性小鼠所生55只F2代中，PCR檢測陽性率36.36％；在活體熒光成像系統(tǒng)下轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)綠色熒光表達。通過睪丸注射法使Thanation基因在小鼠的基因組中得到整合，為今后進一步研究抗菌肽的作用機理